התנהגות נחילים של Pseudomonas aeruginosa תחת עקה אנטיביוטית

תקציר

מקור: Bru, J., et al., הדמיית זמן-lapse של נחילי חיידקים ותגובת הלחץ הקולקטיבית. J. Vis. Exp. (2020)

סרטון זה מדגים את ההליך לניתוח התנהגות הנחיל של Pseudomonas aeruginosa על ידי התבוננות בצמיחת חיידקים מתרבית מרכזית לעבר נקודות לוויין המכילות את אותה תרבית מעורבת עם אנטיביוטיקה, באמצעות מערך צלחת אגר והדמיית זמן-lapse.

פרוטוקול

1. צמיחה של P. aeruginosa ותנאי ציפוי

1. הכינו 400 מ"ל מרק ליזוגני (LB) על ידי הוספת 10 גרם תערובת אבקת LB-Miller ל-400 מ"ל ddH₂O. הוסיפו 8 גרם אגר נוספים למנות פטרי של 2% LB-אגר. חיטוי לעיקור.
2. יוצקים 20 מ"ל מדיום LB-אגר מותך לצלחות פטרי בקוטר 10 ס"מ ומניחים להם להתמצק בטמפרטורת החדר למשך הלילה. אחסן את המדיה הנוזלית בטמפרטורת החדר ואת צלחות האגר ב-4 מעלות צלזיוס.
3. פס P . aeruginosa על צלחת פטרי LB-agar מציר קפוא המאוחסן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס באמצעות לולאות סטריליות או מקלות עץ. דגרו את צלחת הפטרי הפוכה למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס. אחסן את צלחת LB-agar ב-4 מעלות צלזיוס עד שבוע.
4. בחר מושבה בודדת מצלחת הפטרי עם לולאה סטרילית או מקל עץ, חסן אותה למדיום LB של 2 מ"ל, ודגר את התרבית לרוויה למשך הלילה (16-18 שעות) ב-37 מעלות צלזיוס בתוף רולר המוגדר ב-100 סל"ד.
5. פיפט 5 מיקרוליטר של תרבית לילה משלב 1.4 באמצעות פיפט P20 ונקודה במרכז צלחת האגר הנחיל על ידי התקרבות לקצה הפיפט בזווית (10-45°) 2.5 ס"מ מעל אזור האיתור, פיפטינג עד לעצירה הראשונה ונגיעה באגר עם טיפת הנוזל בלבד (איור 1B).
   1. הימנע מלגעת באגר עם קצה הפיפטה, מכיוון שהדבר עלול לפגוע באגר. השתמש בתבנית כדי למקם את הנקודה באופן עקבי על פני צלחות אגר נחילים שונות.
6. לטיפולים אנטיביוטיים, יש לערבב 30 מיקרוליטר תרבית לילה P. aeruginosa משלב 1.4 עם 6 מיקרוליטר של 3 מ"ג/מ"ל גנטמיצין, 10 מיקרוליטר של 100 מ"ג/מ"ל קנמיצין, או 7.5 מיקרוליטר של 100 מ"ג/מ"ל פוספומיצין. המשך מיד לשלב הבא.
   1. פיפט 6 מיקרוליטר של P. aeruginosa שטופל באנטיביוטיקה באמצעות פיפטה P20 ונקודה ב-6 מיקומי לוויין במרחקים שווים על מעגל קונצנטרי ברדיוס 2.8 ס"מ סביב מרכז הצלחת על ידי התקרבות לקצה הפיפט בזווית (10 עד 45 מעלות) 2.5 ס"מ מעל אזור האיתור, פיפטינג עד לתחנה הראשונה, ונגיעה באגר עם טיפת הנוזל בלבד (איור 1D).
   2. הימנע מלגעת באגר עם קצה הפיפטה, מכיוון שהדבר עלול לפגוע בו. השתמש בתבנית ציפוי לעקביות.
7. החלף את מכסי צלחת הפטרי השקופים במכסים שחורים (איור 2A).
8. הניחו את צלחות האגר הנחיל על סורק באינקובטור המוגדר ל-37 מעלות צלזיוס עם אמבט מים של 10 ליטר כדי לשמור על לחות של 75% (איור 1E, איור 2B). זהירות: אל תפריע לתאים מנומרים על צלחות האגר הנחילות. שמור על הצלחות כלפי מעלה כל הזמן.

תוצאות

איור 1: סכמטי של מבחן נחיל P. aeruginosa ותגובת עקה קולקטיבית. (A) תאי P. aeruginosa גדלים בן לילה (16-18 שעות עד_{OD 600} של כ-1.5) במרק LB בטמפרטורה של 37 מעלות צלזי...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
ריאגנטים
בקטו אגר, מיובש	BD דיפקו	214010	עבור צלחת LB-agar וצלחת אגר נחיל
חומצות קסאמינו	BD דיפקו	223050	לנחילי מדיה
D-גלוקוז	פישר כימיקלים	D16500	דקסטרוז. לנחילי מדיה
מלח דיסודיום פוספומיצין	התעשייה הכימית של טוקיו	F0889	ריכוז מלאי: 200 מ"ג / מ"ל. מומס ב- ddH₂O
גנטמיצין סולפט	סיגמא-אולדריץ'	G1914	ריכוז מלאי: 3 מ"ג / מ"ל. מומס ב- ddH₂O
קנמיצין סולפט	סיגמא-אולדריץ'	60615	ריכוז מלאי: 100 מ"ג / מ"ל. מומס ב- ddH₂O
LB-מילר	BD דיפקו	244620	למרק LB וצלחות LB-agar
מגנזיום גופרתי הפטהידרט	סיגמא-אולדריץ'	230391	לנחילי מדיה
זנים
Pseudomonas aeruginosa	מעבדת סיריאפורן	AFS27E.118	זן PA14
אספקה
נייר זכוכית תחמוצת אלומיניום	3 דקות	150 קנס	לעפעפיים שחורים
בד שחור	אנונימי	PRD7089	בד שחור
ספריי צבע שחור	קרילון	5592 שחור מט	לעפעפיים שחורים
בקבוק ארלנמאייר	קימקס	26500	250 מ"ל
בקבוקי אחסון מזכוכית	פיירקס	13951 ליטר	250 מ"ל, 500 מ"ל, 1000 מ"ל
קשרי רוכסן 8 אינץ'	גרדנר בנדר	E173770	להצמדת בד מט שחור
צלחות פטרי (100 מ"מ על 15 מ"מ)	פישר	FB0875712	לוחות פוליסטירן 100X15 מ"מ
מקלות עץ	פישר	23-400-102	לפסים וחיסון חיידקים
ציוד
אוטוקלאב	מרקט פורג' תעשיות	STM-E	לעיקור ריאגנטים
פיפטה 25 מ"ל	ארה"ב סיינטיפיק בע"מ	1072-5410	לפיפט 20 מ"ל לנחיל צלחות אגר
מסיר לחות	פריג'ידר	FAD704DWD 70 ליטר	לתחזוקה לחות יחסית בחדר בכ-45%
אינקובטור	VWR	89032-092	לגידול חיידקים ב-37 מעלות צלזיוס
אמבט מים איזוטמפ	פישר	15-462-21ש	לקירור מדיה ל-55 מעלות צלזיוס
קולט אדים למינרי	חברת בייקר	SG603א	לייבוש צלחות
פיפט P-20	גילסון	F123601	תצפית על צלחות אגר נחילים
בקר פיפטה	ברנדטק	אקיו-ג'ט	לפיפט 20 מ"ל לנחיל צלחות אגר