אינדוקציה של התמיינות של Vibrio parahaemolyticus לתאי נחיל

תקציר

מקור: Heering, J., et al. אינדוקציה של התמיינות תאית והדמיה של תאים בודדים של תאי שחיין ונחיל Vibrio parahaemolyticus . J. Vis. Exp. (2017)

סרטון זה מדגים את השראת התמיינות תאי הנחיל ב-Vibrio parahaemolyticus באמצעות מדיום אגר שהוכן במיוחד. על ידי מניפולציה של רמזים סביבתיים כגון דלדול ברזל, תוספת סידן ומגע עם פני השטח, החיידקים מגורים לעבור מצורת השחיין שלהם לתאי נחיל מוארכים עם דגלים לרוחב. תאים מובחנים אלה מתפשטים על פני השטח המוצק, ויוצרים התפרצויות נחיל אופייניות המסמלות שינוי מורפולוגי מוצלח.

פרוטוקול

1. אינדוקציה של התמיינות תאי נחיל

הערה: השלבים הבאים מתארים כיצד לגרום להתמיינות של V. parahaemolyticus למחזור החיים של תאי הנחיל שלו וכיצד לעורר התפשטות על משטחים מוצקים.

1. השעו 4 גרם אגר עירוי לב (HI) ב-100 מ"ל ddH₂O על מנת להכין את צלחות הנחילים.

2. מרתיחים בזהירות את תמיסת ה- HI אגר במיקרוגל ומנערים את הבקבוק מדי פעם עד להמסת האבקה. חיטוי ב-121 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.

3. לאחר החיטוי, יש לקרר את אגר ה-HI ל-60-65 מעלות צלזיוס. הוסף 2,2'-Bipyridyl לריכוז סופי של 50 מיקרומטר (תמיסת מלאי של 50 מ"מ באתנול 100%). הוסף CaCl₂ לריכוז סופי של 4 מ"מ (תמיסת מלאי של 4 מ' ב-ddH₂O). במידת הצורך, הוסף אנטיביוטיקה לתמיסה כדי לשמור על פלסמידים.

הערה: אם מתכננים להשתמש בפלסמיד הניתן להשראה, הוסף חומר מעורר לריכוזו הסופי.

אזהרה: 2,2'-Bipyridyl: רעילות חריפה (דרך הפה, עור, שאיפה). השתמש בכפפות ובמשקפי מגן בעת טיפול בכימיקל זה.

4. יוצקים 30 - 35 מ"ל מתמיסת ה- HI אגר הסופית לצלחת פטרי עגולה בגודל 150 מ"מ ונותנים לאגר להתמצק.

5. ממש לפני איתור תרבית התאים, יש לייבש את צלחת האגר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות לפחות (או עד שנעלמו שאריות נוזלים, אך לא עוד) זקוף עם מכסה פתוח.
הערה: זמני הייבוש תלויים מאוד בחממה המשמשת וצלחות מיובשות בכבדות לא יאפשרו נחיל של V. parahaemolyticus. (שלב זה חשוב מאוד!) יש להשתמש בצלחות טריות ולא צריכות להיות מבוגרות יותר משעתיים - שלוש. צלחות ישנות יהיו יבשות מכדי לעורר נחילים.

6. לחסן כמות קטנה של תאים מקצה מושבה בודדת לתוך 5 מ"ל של מרק לוריא-ברטאני (LB). דגירה על התרבית רועדת ב-37 מעלות צלזיוס עד שמגיעים ל-OD₆₀₀ = 0.8, זה בדרך כלל לוקח בערך 2-3 שעות. לאחר מכן, התאים מוכנים לזיהוי על צלחות אגר נחילי HI.

7. נקודה 1 מיקרוליטר של תרבית תאים במרכז צלחת נחיל אגר HI (איור 1A).

8. תן לנקודה להתייבש (איור 1B).

9. אטמו את הצלחת עם סרט פלסטיק שקוף וודאו שהיא מחוברת היטב, אחרת היא עלולה להתנתק במהלך הדגירה של הלילה (איור 1C).

הערה: חשוב מאוד שהחותם יהיה מושלם. הימנע מהיווצרות בועות אוויר וקפלים לסרט בעת מריחתו.

10. דוגרים את הצלחת בחום של 24 מעלות צלזיוס למשך הלילה. זה יביא להיווצרות מושבת נחיל V. parahaemolyticus עם התפרצויות נחילים המשתרעות מהפריפריה של מושבת הנחיל (איור 2).

תוצאות

איור 1: אינדוקציה של התמיינות נחיל והכנת תאים להדמיית מיקרוסקופיה. הדמיה פשוטה של זרימת העבודה לייצור תאי נחיל V. parahaemolyticus והכנת שקופיות מיקרוסקופ לניתוח מיקרוסקופ של תאי נחיל בודדים. (A) נקודה 1 מיקרוליטר של ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
רכיבי מדיה
LB בינוני	רוט	X968.3
דיפקו אגר, מגורען	ב.ד.	214510	להכנת אגר LB עם מדיום LB
Difco עירוי לב אגר	ב.ד.	244400	להכנת צלחות נחיל HI אגר
Agarose NEEO, איכות אולטרה	רוט	2267.3	להכנת רפידות אגרוז מיקרוסקופיות
תוספים
2,2'-ביפירידיל	סיגמא אולדריץ'	D216305-25G	להכנת צלחות נחיל HI אגר
סידן כלוריד דיהידראט	רוט	5239.1	להכנת צלחות נחיל HI אגר
חומרה
צלחת פטרי 150 מ"מ על 20 מ"מ עם מצלמות	סרשטדט	82.1184.500	להכנת צלחות נחיל HI אגר
קלביטרון ט (B 6420)	הראוס	-	משמש לייבוש צלחות נחיל HI אגר