ניטור זיהום חיידקי ואספקת חלבון אפקטור בתאי הצמח

תקציר

מקור: Lee, H. et al., מערכת חלבון פלואורסצנטי ירוקה מפוצלת להדמיית אפקטורים המועברים מחיידקים במהלך זיהום. J. Vis. Exp. (2018)

סרטון זה מדגים שיטה לניטור זיהום חיידקי ואספקת חלבון אפקטור בתאי צמחים באמצעות השלמת חלבון פלואורסצנטי ירוק מפוצל (sfGFP) בשילוב עם מיקרוסקופיה קונפוקלית. הגישה מאפשרת הדמיה מדויקת של טרנסלוקציה של אפקטור לציטוזול התא המארח.

פרוטוקול

הערה: כל השלבים מבוצעים בטמפרטורת החדר אלא אם צוין אחרת.

1. הכנת חומרים צמחיים (4 שבועות)

1. הכנה לצמחי Nicotiana benthamiana
   1. זרעו 2 זרעים של N. benthamiana על פני האדמה של כל עציץ, כסו את המגש בכיפת פלסטיק ואפשרו לזרעים לנבוט בתא גידול של 25 מעלות צלזיוס, 60% לחות עם מחזור אור / חושך של 16/8 שעות.
   2. לאחר שבועיים, בחרו והשליכו את השתיל הקטן ביותר בכל סיר. המשך לגדל צמחים באותם תנאי גידול כמו מיושמים לנביטה בשלב 1.1.1. הוסף 1 ליטר מים למגש כל יומיים.
      הערה: תנאי הגידול של צמחים עשויים להשתנות בין מעבדות. לכן, עקוב אחר פרוטוקול ההשקיה הרגיל כדי לגדל את הצמח במצב בריא.
   3. בעוד שבוע העבירו את הצמחים למגש חדש וסדרו אותם עם מקום מספיק להמשך צמיחה. המשיכו לגדל את הצמחים בתנאים המתוארים בשלב 1.1.1 עד שהם מוכנים לחדירה בגיל 4 שבועות.
      הערה: גידול הצמחים עשוי להשתנות בהתאם לתנאי הגידול במעבדות. בדרך כלל, אנו מוצאים שצמחי N. benthamiana בני 4 שבועות נושאים כשישה עלים.
2. הכנה לצמחים טרנסגניים Arabidopsis thaliana
   1. עיין בטבלת החומרים וסדר את זרעי ה- Arabidopsis הטרנסגניים.
   2. משרים ~50 - 100 זרעי Arabidopsis טרנסגניים ב-1 מ"ל מים מזוקקים ומאחסנים אותם בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 3 ימים בחושך כדי לסנכרן את תחילת הנביטה.
   3. זורעים ~ 2 - 3 זרעים על פני האדמה של מגש צמח תקע ומכסים את המגש בכיפת פלסטיק. אפשר לזרעים לנבוט בטמפרטורה של 23 מעלות צלזיוס, 60% לחות עם מחזור אור / חושך של 10/14 שעות.
      הערה: הזרעים צריכים להיות הומוזיגוטיים. עם זאת, אנו ממליצים לאשר מחדש את נוכחות הטרנסגן באצווה. במקרה זה, יש לעקר את הזרעים על ידי שטיפה עם 70% אתנול למשך 2 דקות, 50% אקונומיקה (כ -2% היפוכלוריט) המכילה 0.05% טריטון X-100 למשך 5 דקות. לאחר מכן שטיפה 5 - 6 פעמים במים מזוקקים כפולים סטריליים (ddH₂O). לאחר העיקור, יש לרבד ב-4 מעלות צלזיוס למשך 3 ימים ולצלוח אותם על מצע נביטה צמחי המכיל 25 מיקרוגרם/ליטר של היגרומיצין B כדי לבחור את הצמחים הטרנסגניים.
   4. לאחר שבוע, השאירו רק צמח אחד לכל פקק והמשיכו לגדל צמחים באותם תנאי גידול ששימשו לשלב 1.2.3.
      הערה: צמחים בני ארבעה שבועות שימשו לזיהום Pseudomonas syringae . השקו צמחים כל יומיים כדי לשמור על בריאות הצמחים.

2. הכנת תרבית פסאודומונס (~ שבוע)

1. בניית הפלסמיד לטרנספורמציה של פסאודומונס
   1. עיין בטבלת החומרים וסדר את הווקטור/ים הרצויים של וקטור מערכת אספקת אפקטורים מבוססת מערכת הפרשה מסוג III (T3SS).
   2. הכנס את גן האפקטור המעניין לווקטור העברת האפקטור באמצעות שיבוט רקומבינציה ספציפי לאתר.
      הערה: בעת ניטור לוקליזציה תת-תאית של חלבון אפקטור באורך מלא, הכניסו את הגן באורך מלא ל-pBK-GW-1-2 או pBG-GW-1-2. אפשר גם לבחור pBK-GW-1-4 או pBG-GW-1-4 המכילים 2x sfGFP11 (גדיל β 11 של sfGFP) לאות פלואורסצנטי מוגבר. במקרה של אפקטור חלקי חסר פפטיד אות, השתמש ב- pBK-GW-2-2 או pBK-GW-2-4.
2. הפוך את הפלסמיד הנושא אפקטור שהתמזג לתג sfGFP11 ל- P. syringae pv. עגבנייה (Pst) CUCPB5500 באמצעות אלקטרופורציה סטנדרטית.
   הערה: ניתן להשתמש בזנים אחרים של Pseudomonas במידת הצורך. מערכת התגים sfGFP11 בנויה עבור מגוון רחב של וקטורים, וביטוי הגנים של האפקטור מווסת על ידי מקדם AvrRpm1, הניתן להשוואה עם, למשל, Pseudomonas fluorescens (EthAn).
3. פזרו את תאי החיידקים שעברו טרנספורמציה בעדינות על פני צלחות האגר של King's B המכילות 100 מיקרוגרם/מ"ל ריפמפיצין ו-25 מיקרוגרם/מ"ל קנמיצין או 25 מיקרוגרם/מ"ל גנטמיצין. יש לדגור בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס למשך יומיים.
4. יש לחסן מושבה אחת לתוך החומר הנוזלי של King's B באנטיביוטיקה המתאימה לווקטור בו נעשה שימוש, ולגדל את התאים למשך הלילה בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס עם ניעור ב-200 סל"ד.
5. הכינו ציר גליצרול. מוסיפים גליצרול אוטוקלב לריכוז סופי של 50% ומאחסנים בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.

3. ביטוי חולף של sfGFP1-10^OPT ממוקד אברונים (1-10 β-גדיל של sfGFP) ב-N. benthamiana (4 ימים)

1. הכנת תרבית אגרובקטריום
   1. הזמינו את הווקטור/ים הרצויים של פלסמיד/ים sfGFP1-10^OPT ממוקדי אברונים (עיין בטבלת החומרים).
   2. הפוך את הפלסמיד/ים לתאי Agrobacterium tumefaciens זן GV3101. גדל את התאים על מדיום אגר לוריא-ברטאני (LB) בתוספת 50 מיקרוגרם/מ"ל קנמיצין ו-50 מיקרוגרם/מ"ל ריפמפיצין ב-28 מעלות צלזיוס למשך יומיים.
   3. ממושבה בודדת על מדיום אגר LB, יש לחסן את התאים ל-5 מ"ל של חומר LB נוזלי בתוספת 50 מיקרוגרם/מ"ל קנמיצין ו-50 מיקרוגרם/מ"ל ריפמפיצין. גדל את התאים למשך הלילה ב-28 מעלות צלזיוס עם טלטול ב-200 סל"ד.
   4. קצרו את התאים על ידי צנטריפוגה בטמפרטורה של 3,000 x גרם למשך 10 דקות. שפכו את המדיה העליונה והשעו מחדש את הגלולה ב-1 מ"ל של מאגר הסתננות טרי.
   5. מדוד את כמות האגרובקטריום על ידי השגת ערך הצפיפות האופטית (OD) בספיגה של 600 ננומטר (Abs 600 ננומטר). כוונן את ה-OD₆₀₀ של החיידקים ל-0.5 עם מאגר הסתננות.
      הערה: מספיק 1 מ"ל מתלה כדי לחדור בשתי נקודות.
   6. השאירו את התרבות בטמפרטורת החדר על נדנדה עדינה למשך 1-5 שעות לפני ההסתננות.
   7. תקעו חור במרכז העלים כדי לחדור עם קצה של 10 מיקרוליטר. השתמש במזרק ללא מחט של 1 מ"ל כדי לחדור למתלי האגרובקטריום . הזרקו בזהירות ובאיטיות כ-500 מיקרוליטר מהמתלים שהוכנו משלב 3.1.5 לצד האדאקסיאלי של העלה דרך המזרק. חזור על ההסתננות על לפחות שלושה צמחים שונים לשכפולים ניסיוניים.
      הערה: מטעמי בריאות ובטיחות, יש ללבוש מגן עיניים במהלך ההסתננות.
   8. נגב את תרחיף החיידקים שנותר על העלים וסמן את גבול האזור שהסתנן.
   9. שמור את הצמחים שחדרו באותם תנאי גידול המשמשים לשלב 1.1.1 למשך יומיים.

4. חיסון פסאודומונס (4 ימים)

1. פס את זן Pseudomonas שעבר טרנספורמציה ממלאי הגליצרול בשלב 2.5 על מדיה אגר B של King's עם האנטיביוטיקה המתאימה ב-28 מעלות צלזיוס למשך יומיים.
   הערה: הבריאות של Pseudomonas היא קריטית מאוד. אם מושבות אינן נוצרות היטב, פס שוב את התאים או הפיץ את התאים במדיה הנוזלית של המלך לפני שתמשיך.
2. יש לחסן לולאה של תאי Pseudomonas בחומר נוזלי Mannitol-Glutamate (MG) בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס עם ניעור ב-200 סל"ד למשך הלילה.
3. קצרו את התאים על ידי צנטריפוגה בטמפרטורה של 3,000 x גרם למשך 10 דקות. שפכו את המדיה העליונה, השעו מחדש את הגלולה ב-10 מ"מ MgCl₂, והתאימו את ה-OD₆₀₀ ל-0.02 (1 x 10⁷ cfu/mL) עבור עלי N. benthamiana ול-0.002 (1 x 10⁶ cfu/mL) עבור עלי Arabidopsis.
4. עבור N. benthamiana, הסתנן לתרחיף Pseudomonas לאזור העלים שבו חדר ה-Agrobacterium הנושא את מבנה sfGFP1-10^OPT יומיים קודם לכן (כמו בשלב 3.1.7). עבור ה-sfGFP1-10^OPT הטרנסגני Arabidopsis, החדרו את תרחיף Pseudomonas לשני עלים קצרים בני 4 שבועות שגדלו ביום.
   הערה: דרושים לפחות שלושה צמחים לשכפולים ניסיוניים.

5. תצפית על אות sfGFP באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית (יום אחד)

1. גזרו את דיסק העלים מהעלים המחוסנים בפסאודומונס. בנקודות זמן ספציפיות לאחר חדירת Pseudomonas, דמיין שני דיסקי^עלים בגודל 2 ס"מ מהצמח הבודד באמצעות מערכת קונפוקלית לסריקת לייזר עם צמצם מספרי 40X/1.2 C-Apochromat מטרת טבילה במים או מטרת טבילה בשמן 63X/0.8 NA C-Apochromat. כדי למנוע תאים מתים שנהרגים מפציעה, התבוננו בתאים הרחק מחור ההסתננות.
2. התחל את התצפית בהגדרת הספק נמוך של לייזר ארגון 488 ננומטר. הגדל את עוצמת הלייזר כדי לזהות sfGFP.
   הערה: בדרך כלל אנו משתמשים ב-2-15% מעוצמת הלייזר כדי לזהות את אות הקרינה. עם זאת, יש להתאים את הגדרות עוצמת הלייזר והזיהוי על סמך מערכת המיקרוסקופיה של המשתמש. כאן, מסנני הפליטה הוגדרו ל-520 - 550 ננומטר. התאים המתים פולטים לעתים קרובות פלואורסצנטיות עצמית תחת עירור לייזר של 488 ננומטר. לכן, כבקרה שלילית, יש לחדור לאותו אפקטור ללא תג sfGFP11 ולצפות בו באותם תנאי תצפית. בנוסף, עירור לייזר גבוה יכול לגרום לאוטופלואורסצנציה של כלורופיל. לכן, התאם את עוצמת הלייזר באמצעות תאי צמח הבקרה כדי לא לגרום לאוטופלואורסצנטיות של כלורופיל.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
קווים טרנסגניים של Arabidopsis			Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. ניטור מרחבי-זמני של אפקטורים של Pseudomonas syringae באמצעות הפרשה מסוג III באמצעות שברי חלבון פלואורסצנטי מפוצלים. תא צמחי. 29 (7), 1571-1584 (2017)
ציטו-sfGFP1-10	ABRC	CS69831
NU-SFGFP1-10	ABRC	CS69832
PT-sfGFP1-10	ABRC	CS69833
MT-sfGFP1-10	ABRC	CS69834
PX-sfGFP1-10	ABRC	CS69835
ER-sfGFP1-10	ABRC	CS69836
GO-sfGFP1-10	ABRC	CS69837
PM-sfGFP1-10	ABRC	CS69838
פלסמיד sfGFP1-10OPT ממוקד אברונים			Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. ניטור מרחבי-זמני של אפקטורים של Pseudomonas syringae באמצעות הפרשה מסוג III באמצעות שברי חלבון פלואורסצנטי מפוצלים. תא צמחי. 29 (7), 1571-1584 (2017)
ציטו-sfGFP1-10	אדג'ן	97387
NU-SFGFP1-10	אדג'ן	97388
PT-sfGFP1-10	אדג'ן	97389
MT-sfGFP1-10	אדג'ן	97390
PX-sfGFP1-10	אדג'ן	97391
ER-sfGFP1-10	אדג'ן	97392
GO-sfGFP1-10	אדג'ן	97393
PM-sfGFP1-10	אדג'ן	97394
ER-sfCherry1-10	אדג'ן	97403
ER-sfYFP1-10	אדג'ן	97404
ציטו-sfCFP1-10	אדג'ן	97405
וקטור תואם שער מתויג sfGFP11 עבור מערכת אספקת אפקטורים מבוססת T3SS	Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. ניטור מרחבי-זמני של אפקטורים של Pseudomonas syringae באמצעות הפרשה מסוג III באמצעות שברי חלבון פלואורסצנטי מפוצלים. תא צמחי. 29 (7), 1571-1584 (2017)
pBK-GW-1-2	אדג'ן	98250	pAvrRpm1:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; עמיד בפני קנמיצין (25 ug/ml)
pBK-GW-1-4	אדג'ן	98251	pAvrRpm1:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; עמיד בפני קנמיצין (25 ug/ml)
pBK-GW-2-2	אדג'ן	98252	pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; עמיד בפני קנמיצין (25 ug/ml)
pBK-GW-2-4	אדג'ן	98253	pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; עמיד בפני קנמיצין (25 ug/ml)
pBG-GW-1-2	אדג'ן	98254	pAvrRpm1:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; עמיד בפני גנטמיצין (25 ug/ml)
pBG-GW-1-4	אדג'ן	98255	pAvrRpm1:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; עמיד בפני גנטמיצין (25 ug/ml)
pBG-GW-2-2	אדג'ן	98256	pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; עמיד בפני גנטמיצין (25 ug/ml)
pBG-GW-2-4	אדג'ן	98257	pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; עמיד בפני גנטמיצין (25 ug/ml)
זני חיידקים
Agrobacterium tumefaciens GV3101			צ'אבה קונץ וג'ף של, המקדם של גן TL-DNA 5 שולט בביטוי הספציפי לרקמה של גנים כימריים הנישאים על ידי סוג חדש של וקטור בינארי של אגרובקטריום. מול ג'נט ג'נט. 204,383-396 (1986); עמיד בפני גנטמיצין (50 ug/ml) וריפמפיצין (50 ug/ml)
Pseudomonas syringae pv. עגבניות CUCPB5500			קוויטקו, ב. ה. ואחרים. מחיקות ברפרטואר של Pseudomonas syringae pv. גנים של אפקטור הפרשה עגבניות DC3000 מסוג III חושפים חפיפה תפקודית בין אפקטורים. PLoS Pathog. 5 (4) (2009).; עמיד בפני ריפמפיצין (100 ug/ml)
רכיבי מדיה
אמצעי נביטת צמחים			מוסיפים 2.165 גרם/ליטר אבקת Murashige & Skoog, 10 גרם/ליטר סוכרוז למים. התאימו ל-pH 5.8 והוסיפו 2.2 גרם/ליטר פיטגל. אוטוקלבה.
מדיום Murashige & Skoog כולל ויטמינים	דושה ביוכימיה	M0222	יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
סוכרוז	דושה ביוכימיה	S0809
פיטאג'ל	סיגמא-אולדריץ'	עמ' 8169
מדיה LB			יש להוסיף למים 10 גרם/ליטר טריפטון, 5 גרם/ליטר תמצית שמרים, 10 גרם/ליטר NaCl. למדיה מוצקה, הוסף 15 גרם/ליטר מיקרו אגר. חיטוי. מניחים לתמיסה להתקרר ל-55 מעלות צלזיוס, ומוסיפים אנטיביוטיקה במידת הצורך.
טריפטון	BD ביוסיינס	211705
תמצית שמרים	BD ביוסיינס	212750
NaCl	דושה ביוכימיה	S0520
מיקרו אגר	דושה ביוכימיה	M1002
קינגס בי מדיה			10 גרם/ליטר פרוטאז פפטון #2, 1.5 גרם/ליטר נטול מים K2HPO4, 15 גרם/ליטר אגר למים. חיטוי. מצננים ל-55 מעלות צלזיוס ומוסיפים 15 מ"ל/ליטר גליצרול סטרילי, 5 מ"ל/ליטר MgSO4 למדיום. הוסף אנטיביוטיקה במידת הצורך.
פפטון פרוטאוז	BD ביוסיינס	212120
נטול מים K2HPO4	סיגמא-אולדריץ'	1551128 USP
גליצרול	דושה ביוכימיה	G1345
מגסו4	סיגמא-אולדריץ'	M7506
בקטו אגר	BD ביוסיינס	214010
חומר נוזלי מניטול-גלוטמט (MG)			יש להוסיף למים 10 גרם/ליטר של מניטול, 2 גרם/ליטר של חומצה L-גלוטמית, 0.5 גרם/ליטר של KH2PO4, 0.2 גרם/ליטר של NaCl ו-0.2 גרם/ליטר של MgSO4 . התאם ל-pH 7
מניטול	דושה ביוכימיה	M0803
חומצה L-גלוטמית	דושה ביוכימיה	G0707
ק"ח2פ"ד4	סיגמא-אולדריץ'	NIST200B
מאגר הסתננות			10 מ"מ MES (2-(N-morpholino)-אתאן חומצה סולפונית), 10 מ"מ MgCl2, 150 מיקרומטר אצטוסירינגון. pH 5.6; הכן חיץ טרי לפני השימוש.
MES	דושה ביוכימיה	M1503	הכן מלאי של 100 מ"מ (pH 5.6) במים. מסננים לעקר.
MgCl2	סיגמא-אולדריץ'	M8266	הכן מלאי 100 מ"מ במים. חיטוי.
אצטוסירינגון	סיגמא-אולדריץ'	D134406	הכן מלאי 150 מ"מ ב-DMSO.
ציוד/חומרים למיקרוסקופ קונפוקלי
מערכת קונפוקלית לסריקת לייזר 710	קרל זייס
Axio observer Z1 מיקרוסקופ הפוך	קרל זייס