סרטון זה מדגים שיטה לניטור זיהום חיידקי ואספקת חלבון אפקטור בתאי צמחים באמצעות השלמת חלבון פלואורסצנטי ירוק מפוצל (sfGFP) בשילוב עם מיקרוסקופיה קונפוקלית. הגישה מאפשרת הדמיה מדויקת של טרנסלוקציה של אפקטור לציטוזול התא המארח.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
ניטור זיהום חיידקי ואספקת חלבון אפקטור בתאי הצמח
650 צפיות
⸱
26 בספטמבר 2025
במאמר זה
תקציר
פרוטוקול
הערה: כל השלבים מבוצעים בטמפרטורת החדר אלא אם צוין אחרת.
1. הכנת חומרים צמחיים (4 שבועות)
- הכנה לצמחי Nicotiana benthamiana
- זרעו 2 זרעים של N. benthamiana על פני האדמה של כל עציץ, כסו את המגש בכיפת פלסטיק ואפשרו לזרעים לנבוט בתא גידול של 25 מעלות צלזיוס, 60% לחות עם מחזור אור / חושך של 16/8 שעות.
- לאחר שבועיים, בחרו והשליכו את השתיל הקטן ביותר בכל סיר. המשך לגדל צמחים באותם תנאי גידול כמו מיושמים לנביטה בשלב 1.1.1. הוסף 1 ליטר מים למגש כל יומיים.
הערה: תנאי הגידול של צמחים עשויים להשתנות בין מעבדות. לכן, עקוב אחר פרוטוקול ההשקיה הרגיל כדי לגדל את הצמח במצב ב....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| קווים טרנסגניים של Arabidopsis | Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. ניטור מרחבי-זמני של אפקטורים של Pseudomonas syringae באמצעות הפרשה מסוג III באמצעות שברי חלבון פלואורסצנטי מפוצלים. תא צמחי. 29 (7), 1571-1584 (2017) | ||
| ציטו-sfGFP1-10 | ABRC | CS69831 | |
| NU-SFGFP1-10 | ABRC | CS69832 | |
| PT-sfGFP1-10 | ABRC | CS69833 | |
| MT-sfGFP1-10 | ABRC | CS69834 | |
| PX-sfGFP1-10 | ABRC | CS69835 | |
| ER-sfGFP1-10 | ABRC | CS69836 | |
| GO-sfGFP1-10 | ABRC | CS69837 | |
| PM-sfGFP1-10 | ABRC | CS69838 | |
| פלסמיד sfGFP1-10OPT ממוקד אברונים | Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. ניטור מרחבי-זמני של אפקטורים של Pseudomonas syringae באמצעות הפרשה מסוג III באמצעות שברי חלבון פלואורסצנטי מפוצלים. תא צמחי. 29 (7), 1571-1584 (2017) | ||
| ציטו-sfGFP1-10 | אדג'ן | 97387 | |
| NU-SFGFP1-10 | אדג'ן | 97388 | |
| PT-sfGFP1-10 | אדג'ן | 97389 | |
| MT-sfGFP1-10 | אדג'ן | 97390 | |
| PX-sfGFP1-10 | אדג'ן | 97391 | |
| ER-sfGFP1-10 | אדג'ן | 97392 | |
| GO-sfGFP1-10 | אדג'ן | 97393 | |
| PM-sfGFP1-10 | אדג'ן | 97394 | |
| ER-sfCherry1-10 | אדג'ן | 97403 | |
| ER-sfYFP1-10 | אדג'ן | 97404 | |
| ציטו-sfCFP1-10 | אדג'ן | 97405 | |
| וקטור תואם שער מתויג sfGFP11 עבור מערכת אספקת אפקטורים מבוססת T3SS | Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. ניטור מרחבי-זמני של אפקטורים של Pseudomonas syringae באמצעות הפרשה מסוג III באמצעות שברי חלבון פלואורסצנטי מפוצלים. תא צמחי. 29 (7), 1571-1584 (2017) | ||
| pBK-GW-1-2 | אדג'ן | 98250 | pAvrRpm1:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; עמיד בפני קנמיצין (25 ug/ml) |
| pBK-GW-1-4 | אדג'ן | 98251 | pAvrRpm1:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; עמיד בפני קנמיצין (25 ug/ml) |
| pBK-GW-2-2 | אדג'ן | 98252 | pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; עמיד בפני קנמיצין (25 ug/ml) |
| pBK-GW-2-4 | אדג'ן | 98253 | pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; עמיד בפני קנמיצין (25 ug/ml) |
| pBG-GW-1-2 | אדג'ן | 98254 | pAvrRpm1:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; עמיד בפני גנטמיצין (25 ug/ml) |
| pBG-GW-1-4 | אדג'ן | 98255 | pAvrRpm1:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; עמיד בפני גנטמיצין (25 ug/ml) |
| pBG-GW-2-2 | אדג'ן | 98256 | pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; עמיד בפני גנטמיצין (25 ug/ml) |
| pBG-GW-2-4 | אדג'ן | 98257 | pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; עמיד בפני גנטמיצין (25 ug/ml) |
| זני חיידקים | |||
| Agrobacterium tumefaciens GV3101 | צ'אבה קונץ וג'ף של, המקדם של גן TL-DNA 5 שולט בביטוי הספציפי לרקמה של גנים כימריים הנישאים על ידי סוג חדש של וקטור בינארי של אגרובקטריום. מול ג'נט ג'נט. 204,383-396 (1986); עמיד בפני גנטמיצין (50 ug/ml) וריפמפיצין (50 ug/ml) | ||
| Pseudomonas syringae pv. עגבניות CUCPB5500 | קוויטקו, ב. ה. ואחרים. מחיקות ברפרטואר של Pseudomonas syringae pv. גנים של אפקטור הפרשה עגבניות DC3000 מסוג III חושפים חפיפה תפקודית בין אפקטורים. PLoS Pathog. 5 (4) (2009).; עמיד בפני ריפמפיצין (100 ug/ml) | ||
| רכיבי מדיה | |||
| אמצעי נביטת צמחים | מוסיפים 2.165 גרם/ליטר אבקת Murashige & Skoog, 10 גרם/ליטר סוכרוז למים. התאימו ל-pH 5.8 והוסיפו 2.2 גרם/ליטר פיטגל. אוטוקלבה. | ||
| מדיום Murashige & Skoog כולל ויטמינים | דושה ביוכימיה | M0222 | יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. |
| סוכרוז | דושה ביוכימיה | S0809 | |
| פיטאג'ל | סיגמא-אולדריץ' | עמ' 8169 | |
| מדיה LB | יש להוסיף למים 10 גרם/ליטר טריפטון, 5 גרם/ליטר תמצית שמרים, 10 גרם/ליטר NaCl. למדיה מוצקה, הוסף 15 גרם/ליטר מיקרו אגר. חיטוי. מניחים לתמיסה להתקרר ל-55 מעלות צלזיוס, ומוסיפים אנטיביוטיקה במידת הצורך. | ||
| טריפטון | BD ביוסיינס | 211705 | |
| תמצית שמרים | BD ביוסיינס | 212750 | |
| NaCl | דושה ביוכימיה | S0520 | |
| מיקרו אגר | דושה ביוכימיה | M1002 | |
| קינגס בי מדיה | 10 גרם/ליטר פרוטאז פפטון #2, 1.5 גרם/ליטר נטול מים K2HPO4, 15 גרם/ליטר אגר למים. חיטוי. מצננים ל-55 מעלות צלזיוס ומוסיפים 15 מ"ל/ליטר גליצרול סטרילי, 5 מ"ל/ליטר MgSO4 למדיום. הוסף אנטיביוטיקה במידת הצורך. | ||
| פפטון פרוטאוז | BD ביוסיינס | 212120 | |
| נטול מים K2HPO4 | סיגמא-אולדריץ' | 1551128 USP | |
| גליצרול | דושה ביוכימיה | G1345 | |
| מגסו4 | סיגמא-אולדריץ' | M7506 | |
| בקטו אגר | BD ביוסיינס | 214010 | |
| חומר נוזלי מניטול-גלוטמט (MG) | יש להוסיף למים 10 גרם/ליטר של מניטול, 2 גרם/ליטר של חומצה L-גלוטמית, 0.5 גרם/ליטר של KH2PO4, 0.2 גרם/ליטר של NaCl ו-0.2 גרם/ליטר של MgSO4 . התאם ל-pH 7 | ||
| מניטול | דושה ביוכימיה | M0803 | |
| חומצה L-גלוטמית | דושה ביוכימיה | G0707 | |
| ק"ח2פ"ד4 | סיגמא-אולדריץ' | NIST200B | |
| מאגר הסתננות | 10 מ"מ MES (2-(N-morpholino)-אתאן חומצה סולפונית), 10 מ"מ MgCl2, 150 מיקרומטר אצטוסירינגון. pH 5.6; הכן חיץ טרי לפני השימוש. | ||
| MES | דושה ביוכימיה | M1503 | הכן מלאי של 100 מ"מ (pH 5.6) במים. מסננים לעקר. |
| MgCl2 | סיגמא-אולדריץ' | M8266 | הכן מלאי 100 מ"מ במים. חיטוי. |
| אצטוסירינגון | סיגמא-אולדריץ' | D134406 | הכן מלאי 150 מ"מ ב-DMSO. |
| ציוד/חומרים למיקרוסקופ קונפוקלי | |||
| מערכת קונפוקלית לסריקת לייזר 710 | קרל זייס | ||
| Axio observer Z1 מיקרוסקופ הפוך | קרל זייס |
