בידוד מושבת חיידקים ממוקד באמצעות פירוק הידרוג'ל בדוגמת אור

Abstract

מקור: Fattahi, N., et al. ממשקי הידרוג'ל מתכלים לסינון, בחירה ובידוד חיידקים. J. Vis. Exp. (2021).

סרטון זה מדגים את מיצוי מושבות החיידקים מהידרוג'ל מתכלה באמצעות אור UV. נבחרת מושבה ספציפית, וחשיפה לאור מעוצב נועדה ליזום פירוק הידרוג'ל מקומי. לאחר התאמת עוצמת האור ומשך האור, אור ה-UV מופעל ומשחרר את המושבה. לאחר מכן המושבה נשאבת דרך צינורות ומועברת לצינור לניתוח במורד הזרם.

Protocol

1. זני חיידקים ופרוטוקולי תרבית

1. פס מושבות של חיידקים על צלחות אגר בתוספת אמצעי גידול מתאימים. בדוח זה, B. subtilis (זן 1A1135, Bacillus Genetic Stock Center) מתורבת על ATGN (0.079 M KH₂PO₄ (אשלגן דימימן פוספט), 0.015 M (NH₄)₂SO₄ (אמוניום גופרתי), 0.6 מ"מ MgSO₄·7H₂O (מגנזיום גופרתי הפטהידרט), 0.06 מ"מ CaCl₂·2H₂O (סידן כלורי דיהידרט), 0.0071 מ"מ MnSO₄·H₂O (מנגן (II) סולפט מונוהידרט), 0.125 M FeSO₄·7H₂O (ברזל סולפט הפטהידרט), 28 מ"מ גלוקוז, pH: 7 ± 0.2, 15 גרם/ליטר אגר) צלחות אגר בתוספת 100 מיקרוגרם/מ"ל ספקטינומיצין ו-E. coli (זן 25922, ATCC) על צלחות אגר ATGN בתוספת 100 מיקרוגרם/מ"ל אמפיצילין.
   הערה: דיווחים קודמים על אנקפסולציה ושחרור הידרוג'ל עם חומרים אלה השתמשו בתאי A. tumefaciens C58
2. בחר מושבות רצויות מצלחות אגר ATGN והתחל תרביות לילה. עבור זני E. coli ו-B. subtilis המשמשים כאן, תרבית ב-37 מעלות צלזיוס תוך ניעור ב-215 סל"ד במדיום נוזלי ATGN למשך 24 שעות. אחסן את תרביות התאים ב-50% גליצרול ב-80 מעלות צלזיוס עד לשימוש עתידי.
3. בחר מושבות של שני הזנים ממאגרי הגליצרול באמצעות לולאות חיסון סטריליות ודגר במדיה נוזלית ATGN למשך 24 שעות ב-37 מעלות צלזיוס ו-215 סל"ד.

2. הכנת החומר הדרוש להיווצרות הידרוג'ל

1. סינתזת PEG-o-NB-diacrylate (פולי(אתילן גליקול)-אורתו-ניטרובנזיל-דיאקרילט) מתכלה
   הערה: הסינתזה הפנימית של ה-PEG-o-NB-diacrylate תוארה היטב ודווחה בעבר. לחלופין, מכיוון שהסינתזה היא שגרתית, ניתן לבצע מיקור חוץ ממתקן סינתזה כימית.
2. חוצץ צולב
   1. קח את המתכון למדיום הנבחר לזן החיידקים והכין את המדיה עם פי 2 חומרים מזינים. הוסף פוספט, למשל, NaH₂PO₄ (נתרן דימימן פוספט), למדיום לריכוז סופי של 100 מ"מ. לאחר מכן, התאם את ערך ה-pH ל-8 באמצעות 5 M NaOH (נתרן הידרוקסיד) (מימי).
   2. עקר את תמיסת החיץ ואחסן אותה בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף.
      הערה: השאירו את כל מתכות המעבר הקיימות במדיה, מכיוון שמתכות אלו מזרזות את חמצון התיולים לדיסולפידים.
3. תמיסת PEG-o-NB-דיאקרילט
   1. עבור כל מ"ג של אבקת PEG-o-NB-diacrylate (משקל מולקולרי של 3,400 Da), הוסף 3.08 מיקרוליטר מים טהורים במיוחד כדי להגיע לריכוז של 49 מ"מ של PEG-o-NB-diacrylate (ריכוז אקרילט 98 מ"מ).
   2. מערבלים את התמיסה עד שהיא מעורבבת היטב ומאחסנים את התמיסה בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף.
4. תמיסת PEG-thiol בעלת 4 זרועות
   1. להכנת PEG-thiol (משקל מולקולרי של 10,000 Da) בעל 4 זרועות, יש להוסיף 4 מיקרוליטר מים טהורים במיוחד למ"ג אבקה כדי להגיע לריכוז של 20 מ"מ (80 מ"מ של ריכוז תיול).
   2. מערבל תמיסה זו עד שהיא מעורבבת היטב ואחסן תמיסה זו בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף.

3. הכנת כיסויים פרפלואורואלקיליים (לא תגובתיים)

1. הנח עד 5 שקופיות זכוכית (25 מ"מ x 75 מ"מ x 1 מ"מ) בתוך שקופיות פוליפרופילן. סוניקציה של השקופיות עם תמיסת ניקוי של 2% (w/v) (טבלת חומרים) למשך 20 דקות.
2. שטפו את המגלשות שלוש פעמים במים טהורים במיוחד, ולאחר מכן הפכו את המגלשות לסוניקציה במים למשך 20 דקות. יבש את המגלשות באמצעות זרם של N₂ (חנקן).
3. פלזמה נקייה (ראה טבלת חומרים) משני צידי מגלשות הזכוכית לפי הפרוטוקול בסעיף 4.1 למשך 2 דקות.
4. הנח את השקופיות המנוקות בפלזמה בחזרה לדואר השקופיות ומלא את המיכל בתמיסה של 0.5% (v/v) של טריכלורו (1H, 1H, 2H, 2H, -perfluorooctyl) סילאן בטולואן. אפשר לשקופיות הזכוכית הללו להיות פונקציונליות למשך 3 שעות בטמפרטורת החדר (RT).
5. לאחר שהשקופיות מתפקדות, שטפו את השקופיות בתוך מייל השקופיות, תחילה עם טולואן ולאחר מכן אתנול (שלוש פעמים עם כל ממס). לאחר מכן, יבש כל שקופית פונקציונלית עם זרם של N₂.

4. הכנת כיסויים מתפקדים (בסיס)

1. ניקוי כיסויי הזכוכית באמצעות מנקה פלזמה
   1. מניחים כיסויים בגודל 18 מ"מ על 18 מ"מ בצלחת פטרי. לאחר מכן, הנח את צלחת הפטרי בתא ניקוי פלזמה והפעל את הכוח של מנקה הפלזמה.
   2. הפעל את משאבת הוואקום כדי לנקות את האוויר בתוך החדר עד שמד הלחץ קורא 400 mTorr.
   3. פתח את שסתום המדידה כדי להכניס אוויר לתא עד שמד הלחץ מגיע ללחץ קבוע (800-1000 mTorr). לאחר מכן, בחר RF במצב "Hi" וחשוף את הכיסויים למשך 3 דקות.
   4. לאחר 3 דקות, כבה את מצב ה-RF ואת משאבת הוואקום.
   5. הוציאו את צלחת הפטרי מהתא, הפכו את הכיסויים, החזירו אותם לתא לפלזמה וחשפו את הצד השני של כיסוי הזכוכית.
   6. חזור על שלבים 4.1.2-4.1.4 כדי לנקות את הצד הלא מטופל של כיסוי הזכוכית בפלזמה.
   7. לאחר השלמת התהליך, הוציאו את צלחת הפטרי מהתא וכבו את שואב הפלזמה ומשאבת הוואקום.
2. ניקוי והידרוקסילציה של הכיסויים עם תמיסת פיראנה
   הערה: ניתן להשתמש בפרוטוקולי ניקוי פיראנה סטנדרטיים לניקוי והידרוקסילט של החלקות זכוכית. תמיסת פיראנה היא תערובת של 30:70 (v/v) של H₂O₂ (מי חמצן) ו-H₂SO₄ (חומצה גופרתית). ניתן להשתמש גם בשיטות חלופיות לניקוי כיסויי זכוכית.
   זהירות: תמיסת פיראנה היא קורוזיבית ונפיצה מאוד עם ממיסים אורגניים ויש לטפל בה בזהירות רבה. יש ליישם אמצעי בטיחות ובלימה מתאימים, כגון שימוש בציוד מגן אישי מתאים (מעיל מעבדה, סינר עמיד בפני כימיקלים, משקפי בטיחות, מגן פנים, כפפות בוטיל עמידות בפני חומצה). כל כלי הזכוכית ומשטחי העבודה במגע עם תמיסת פיראנה צריכים להיות נקיים, יבשים וללא שאריות אורגניות לפני השימוש. לעולם אין לאחסן תמיסת פיראנה במיכל סגור או סגור חלקית.
   1. מניחים צלחת זכוכית נקייה בגודל 100 מ"מ על 50 מ"מ על מערבל מגנטי עם מהירות ערבוב מתכווננת מתחת למכסה אדים ומוסיפים 14 מ"ל של H₂SO₄ לתבשיל.
   2. הניחו בעדינות מוט ערבוב מגנטי קטן ומצופה טפלון באמצעות מלקחיים מצופים טפלון בתוך המנה. לאחר מכן, סובב את המערבל לאט כדי למנוע התזת החומצה.
   3. לאחר מכן, הוסיפו בעדינות 6 מ"ל של H₂O₂ לתבשיל ואפשרו לתמיסה להתערבב היטב.
   4. כבה את המערבל ולאחר מכן הסר את מוט הערבוב מהכלי באמצעות המלקחיים. לאחר מכן, הניחו בעדינות את הכיסויים בתוך הכלי בעזרת המלקחיים והגדירו את הטמפרטורה ל-60-80 מעלות צלזיוס.
   5. לאחר 30 דקות, הסר בעדינות את החלקות הכיסוי באמצעות המלקחיים וטבל אותם במים נטולי יונים (DI) פעמיים כדי לשטוף את שאריות תמיסת הפיראנה הנותרת.
   6. לאחר שטיפה במים, אחסן את הכיסויים במי DI ב-RT עד לשימוש נוסף.
   7. כבה את משטח החימום ואפשר לתמיסת הפיראנה להתקרר.
   8. כדי להשליך את תמיסת הפיראנה, הניחו בעדינות את צלחת הזכוכית בגודל 100 מ"מ על 50 מ"מ המכילה את תמיסת הפיראנה המקוררת בכוס זכוכית גדולה וריקה בנפח של 1.5 ליטר לפחות. לאחר מכן מוסיפים 1 ליטר מים לדילול ומוסיפים אבקת נתרן ביקרבונט לנטרול. שימו לב שנתרן ביקרבונט יגרום לבעבוע ויצירת חום ויש להוסיף אותו לאט מאוד; אחרת, בעבוע עלול להוביל להתזת החומצה. כאשר תוספת נוספת של נתרן ביקרבונט אינה גורמת לבעבוע, בדוק את ה-pH עם נייר pH כדי לוודא שהוא נוטרל. לאחר שהתמיסה מנוטרלת ומתקררת, ניתן לשפוך אותה לכיור.
3. פונקציונליזציה של תיול של הכיסויים
   1. הכן תמיסה של 5% (v/v) של 269 מ"מ של תמיסת טרימתוקסילן (3-מרקפטופרופיל) (MPTS) בטולואן יבש.
   2. הוסף 10 מ"ל מהתמיסה לצינורות צנטריפוגה חרוטיים בודדים של 50 מ"ל. הנח כיסוי נקי אחד בכל צינור וטבל אותו בתמיסה.
      הערה: כיסוי אחד לכל צינור של 50 מ"ל משמש כדי להבטיח את התיולציה של שני צידי המצע מבלי להפריע על ידי מצעים אחרים.
   3. לאחר 4 שעות, שטפו כל כיסוי (ארבע כביסות לכל כיסוי) עם טולואן, אתנול 1:1 (v/v): תערובת טולואן ואתנול.
      הערה: זה נעשה על ידי טבילת כל כיסוי ברצף לתוך צינורות צנטריפוגה חרוטיים המכילים את התמיסות שהוזכרו.
   4. לאחר שטיפת המצע, טבלו אותו באתנול ואחסנו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף.
      הערה: בהתאם למספר הכיסויים, שיטה זו עלולה להיות מייגעת עקב טיפול בכיסויים בזה אחר זה. עבור מספר כיסויים, ניתן להשתמש בצנצנות קולומביה המתאימות למספר כיסויים בו זמנית.

5. ייצור מערכי מיקרובאר סיליקון

1. ציפוי פארילן: השתמש בפרוטוקול הסטנדרטי המתואר במאמרי מחקר קודמים לציפוי פרוסות סיליקון בפארילן.
2. מיקרו-ייצור: עקוב אחר הפרוטוקול המתואר על ידי Barua et al. כדי לתכנן ולייצר את מערך המיקרו-באר. ​

6. היווצרות הידרוג'ל

1. היווצרות הידרוג'ל בתפזורת על כיסויי זכוכית
   1. תמיסת מבשר הידרוג'ל: הוסף 12.5 מיקרוליטר של מאגר ההצלבה לצינור מיקרוצנטריפוגה של 0.5 מ"ל, ואחריו 5.6 מיקרוליטר של תמיסת PEG-o-NB-diacrylate. לבסוף, הוסף לתערובת 6.9 מיקרוליטר של תמיסת PEG-thiol בעלת 4 זרועות.
      הערה: הוספת תיול PEG בעל 4 זרועות לתערובת יוזמת את תגובת הקישור הצולב. לפיכך, יש להשתמש בתמיסת מבשר ההידרוג'ל מיד לאחר הערבוב.
   2. לאנקפסולציה של תאים בתמיסת מבשר ההידרוג'ל, בצע את השלבים 6.1.3-6.1.9.
   3. עבור עטיפת תאים, לפני שלב 6.1.1, חסנו את מאגר הקישור בצפיפות התאים הרצויה. כפי שדווח קודם לכן19, נצפה כי צפיפות תאים של 7.26 ×^{10 7} CFU/mL במאגר הקישור הצולב מתאמת לצפיפות של ~ 90 תאים/מ"מ² עטופים על פני ההידרוג'ל.
   4. מניחים את כיסוי הבסיס התיולטי על צלחת פטרי נקייה. הנח שני מרווחים (ראה טבלת חומרים) בשני הצדדים המנוגדים של הכיסוי.
      הערה: פונקציונליזציה של תיול של החלקות הכיסוי נחוצה להצמדה קוולנטית של ההידרוג'ל למשטח הכיסוי. זה נעשה באמצעות התגובה של קבוצות תיול על פני השטח וקבוצות האקרילט הקיימות בתמיסת מבשר ההידרוג'ל.
   5. תקן את המרווחים על כיסוי הבסיס על ידי הדבקת המרווחים לצלחת הפטרי.
   6. פיפטה את הנפח הרצוי של תמיסת הפרקורסור על שקופית זכוכית פרפלואורואלקילית.
   7. הנח את שקופית הזכוכית הפרפלואורואלקילית על כיסוי הבסיס (איור 1C). המתן 25 דקות ב-RT להשלמת היווצרות ההידרוג'ל.
   8. לאחר הג'לציה, הסר בעדינות את שקופית הזכוכית הפרפלואורואלקילית. ההידרוג'ל יישאר מחובר לכיסוי הבסיס. ​
      הערה: עבור כיסויים בגודל 18 מ"מ x 8 מ"מ לקבלת קרום בעובי 12.7 מיקרומטר, השתמש ב~7 מיקרוליטר של תמיסת המבשר (איור 1A, B). שימוש בכמויות גדולות יותר של תמיסת פרקורסור עלול לגרום להידרוג'ל מתחת לכיסוי הבסיס. זה עלול לגרום לכיסוי הבסיס להידבק לצלחת פטרי ולהישבר בניסיון הסרה. כמו כן, שאריות הידרוג'ל מתחת לכיסוי בעייתיות למיקרוסקופיה. נדרשת הסרה עדינה של מגלשת הזכוכית הפרפלואורואלקילית, מכיוון שהסרה מהירה עלולה לפגוע בהידרוג'ל.
   9. מניחים את המצע בצלחת פטרי בגודל 60 מ"מ על 15 מ"מ במצע התרבות שצוין. כאן, מדיה ATGN בתוספת ספקטינומיצין של 100 מיקרוגרם/מ"ל עבור B. subtilis או 100 מיקרוגרם/מ"ל אמפיצילין עבור E.coli ב-37 מעלות צלזיוס שימשה לזמני תרבית של 24 שעות.

7. הכנת חומר למיצוי תאים

1. הכנת מחזיק PDMS (פולידימתילסילוקסן)
   1. הדביקו ערימה של עשרה כיסויים בגודל 18 על 18 מ"מ יחד והדביקו את ערימת הכיסויים הזו לתחתית צלחת פטרי.
   2. כדי לייצר מחזיקי PDMS, ערבבו את מבשר ה-PDMS וחומר הריפוי ביחס נפח של 10:1 בכוס פלסטיק, הסירו את התערובת במייבש ואקום ולאחר מכן שפכו את התערובת לתוך צלחת הפטרי.
   3. ריפוי PDMS למשך 90 דקות ב-80 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, חתוך סביב הבלוק המודבק כדי להסיר את מחזיק ה-PDMS והנח את מחזיק ה-PDMS על מגלשת זכוכית לטיפול קל יותר במיקרוסקופיה.
2. הכנת מיקרו-מזרק וצינורות
   1. חותכים 20 ס"מ של צינורות PTFE (פוליטטרפלואורואתילן) (0.05 בתעודת זהות) ומחברים קצה אחד של הצינור למזרק מיקרוליטר של 100 מיקרוליטר.
      הערה: לצורך מיצוי, הימנע משימוש בפיפטות מכיוון שמשיכת התאים המשוחררים דרך קצה פיפטה עלולה לפגוע במשטח ההידרוג'ל ולהוביל לזיהום.

8. פירוק הידרוג'ל עם כלי התאורה המעוצב

1. הפעל את המיקרוסקופ (ראה טבלת החומרים). לאחר מכן, הפעל את כלי התאורה המעוצב (ראה טבלת חומרים).
2. הפעל את מודול הבקרה האנלוגי והדיגיטלי של מקור אור LED 365 ננומטר. לאחר מכן, הפעל את מודול בקרת מקור אור LED.
3. פתח את תוכנת המיקרוסקופ ואת התוכנה עבור כלי התאורה המעוצב. כאשר חלון תצורת החומרה נפתח, בחר בלחצן טען.
   הערה: שלושה מכשירים ייטענו כאן. (מצלמת צד שלישי, מודול בקרה וכלי התאורה המעוצב)
4. לחץ על כפתור התחל. חלון תוכנת דפוס האור ייפתח כעת. בחר באפשרות הראשונה, כפתור בקרת המכשיר, בסרגל הצד השמאלי של החלון.
5. כייל את כלי התאורה המעוצב.
   הערה: הכיול חייב להיעשות עם אותה מטרת מיקרוסקופ ומסנן שישמשו לחשיפה לאור.
   1. הגדר את מטרת המיקרוסקופ להגדלה של פי 10.
      הערה: הגדלה זו מאפשרת מספיק מרחק עבודה בין עדשת המיקרוסקופ למשטח הדגימה. זה גם מאפשר ניטור והקלטה של תהליך האחזור בזמן אמת דרך חלון התמונה.
   2. הגדר את עדשת המיקרוסקופ והמסנן להגדרות המשמשות לחשיפה לאור והנח את מראת הכיול מתחת למיקרוסקופ.
   3. בחלון בקרת התקנים, לחץ על הכרטיסייה בקרת LED. הפעל את LED #1 והגדר את עוצמת האור למספר הרצוי. בניסויי מיצוי סטנדרטיים, זה מוגדר ל-60%.
   4. לחץ על הכרטיסייה שכותרתה עם שם המוצר של כלי התאורה המעוצב בחלון בקרת התקנים. לאחר מכן, לחץ על כפתור הצג רשת.
      הערה: דפוס רשת יוקרן על מראה הכיול.
   5. כוונן את מיקוד המיקרוסקופ ואת חשיפת המצלמה כדי להשיג איכות תמונה גבוהה של הרשת וסובב את המצלמה כדי ליישר את קווי הרשת במקביל למסגרת חלון המצלמה, במידת הצורך.
   6. בחר בלחצן אשף הכיול מתחת לכרטיסייה שכותרתה עם שם המוצר של כלי התאורה המעוצב, ופעל לפי ההוראות המסופקות על ידי התוכנה בחלון זה. הערה: ייפתח חלון הגדרת מצלמה של צד שלישי.
   7. ייפתח חלון בחירת סוג כיול. בחר כיול אוטומטי ולחץ על הבא.
   8. כאשר נפתח חלון התאמת כיול מראש, עקוב אחר הוראות התוכנה ולחץ על כפתור הבא.
   9. כאשר החלון מידע מיפוי נפתח, שמור כיול זה בהתאם בתיקייה הרצויה. זה נעשה על ידי הזנת התאריך, שם המיקרוסקופ, עדשת האובייקט והמסנן.
   10. לאחר הכיול, לחץ על כפתור הגדרת אזור העבודה שנמצא מתחת ללשונית שכותרתה עם שם המוצר של כלי התאורה המעוצב כדי להגדיר את אזור העבודה של כלי התאורה המעוצב במידת הצורך.
6. קטע עיצוב רצף להכנת תבנית.
   1. לחץ על כפתור עיצוב הרצף בסרגל הצד השמאלי של חלון התוכנה. לאחר מכן, לחץ על כפתור עורך רצף הפרופילים.
   2. כאשר החלון עורך רצף פרופילים נפתח, בחר באפשרות פרופיל חדש תחת רשימת פרופילים.
      הערה: כעת, ייפתח חלון עורך תבניות.
   3. הכן את התבנית הרצויה לחשיפה לאור על ידי בחירת צורות וגדלים שונים של דפוס או ציור ידני של התבנית, אם תרצה.
   4. עבור דפוסי עיגול וצלב שבורים עבור ההידרוג'ל בתפזורת, בצע את השלבים 8.6.5- 8.6.6
   5. עבור תבניות מעגל, הגדירו מעגל בקוטר 30 מיקרומטר מעל מושבת חיידקי מטרה כדי לכסות את כל המושבה. בחר את צבע מילוי הצורה לבן.
   6. עבור תבניות צלב שבורות, בחר את צורת המלבן מחלון ציור התבנית עם מידות של 3 מיקרומטר x 8 מיקרומטר. הניחו ארבעה מלבנים עם הממדים הללו בשולי מושבת המטרה, בעוד שלמחצית מהתבניות יש כיסוי עם המושבה.
   7. לדפוסי מעגל וטבעת עבור מערכי המיקרווול, בצע את השלבים 8.6.8-8.6.10.
   8. עבור דפוסי מעגלים, צייר עיגול בקוטר 10 מיקרומטר סביב היקף הבאר. בחר את צבע מילוי הצורה לבן.
   9. לתבנית הטבעת, ציירו עיגול בקוטר 20 מיקרומטר, הניחו אותו מעל הבאר ובחרו את צבע מילוי הצורה לבן.
   10. צייר תבנית עיגול נוספת בקוטר 10 מיקרומטר עם צורת מילוי בצבע שחור והניח אותה סביב היקף הבאר.
7. ערוך את התבנית ושנה את הצורות על סמך שיטת החילוץ הרצויה. ודא שהתבנית הרצויה קיימת באזור העבודה של כלי התאורה המעוצב.
8. הנח את הדגימה במחזיק PDMS ופיפטה את המדיה המוגדרת על גבי הדגימה כדי למנוע התייבשות דגימה ולספק פתרון נשא לתאים משוחררים.
9. לאחר מכן, החלף אותה במראה הכיול.
10. כוונן את מיקוד המיקרוסקופ כדי לקבל תמונה חדה של המושבות בתוך ההידרוג'ל. בדוק את המושבות כדי לזהות מושבה מעניינת.
11. כאן, עצב את דפוסי האור בזמן שתצוגת המצלמה מציגה את המושבות בתוך הדגימה כדי לבדוק דפוסים שונים לחילוץ תאים.
12. שמור את דוגמת המילוי שהוגדרה. לאחר שמירת התבנית שהוגדרה, בחר את המקטע בקרת הפעלה.
13. בחלק זה, תחת הכרטיסייה שכותרתה עם שם המוצר של כלי התאורה המעוצב, הוסף את הרצף השמור.
14. לאחר הוספת הרצף, בחר באפשרות לדמות את הדפוס כדי view ולהתאים למיקום החשיפה הרצוי.
    הערה: ניתן לכוונן את מיקום הדגימה כאן כדי להבטיח שהתבנית מוקרנת במדויק באזור הממוקד.
15. לאחר מכן, כוונן את עוצמת האור ל-60% ואת זמן החשיפה ל-40 שניות תחת לשונית הבקרה LED והתחל בתהליך החשיפה.
16. עקוב אחר פירוק ההידרוג'ל בזמן אמת ובמצב שדה בהיר כדי להבטיח שחרור תאים.
    הערה: מנע כל תנועה לדגימה במהלך חשיפה לאור מכיוון שהיא עלולה לגרום לפירוק של אזורים לא רצויים של ההידרוג'ל וכתוצאה מכך לזיהום צולב.

9. אחזור תאים

1. אחרי חשיפה לאור של 365 ננומטר ושחרור תאים, התאים נאספים באמצעות מזרק מיקרוליטר וצינורות מיקרופלואידיים (איור 2).
   הערה: אחזור תאים צריך להיעשות מיד לאחר חשיפה לדפוס. זה מאפשר התאוששות תאים מקומית לפני שהתאים המשוחררים מתרחקים מהאזור המוקרן.
2. שנה את המיקרוסקופ משדה בהיר למסנן FITC או TRITC כדי לאפשר הדמיה של האזור החשוף של הדגימה בעין בלתי.
3. לאחר איתור האזור החשוף, הנח את קצה הצינור על הנקודה המוקרנת. לאחר מכן, שנה את מסנן המיקרוסקופ בחזרה לשדה בהיר כדי לנטר את אחזור התאים בזמן אמת.
4. השתמש במזרק המחובר לקצה השני של הצינור כדי למשוך בזהירות את התאים המשוחררים. משוך 200 מיקרוליטר מהתמיסה והכנס את התמיסה לצינור צנטריפוגה של 1.5 מ"ל לניתוח או ציפוי DNA.

Results

איור 1: היווצרות הידרוג'ל על כיסויי זכוכית תיולטית. (A) מרווחים בעובי של 12.7 מיקרומטר ממוקמים בשני צדדים מנוגדים של כיסוי בסיס שמכיל קבוצות תיול תגובתיות. (ב) תמיסת קודמן ההידרוג'ל מוזרמת על מגלשת זכוכית פלואורית שאינה מגיבה. (C) מגלשת הזכו...

Materials