כימות אלגינט חיידקי באמצעות בדיקת קרבזול חומצה אורונית

תקציר

מקור: Al Ahmar, R., et al. תרבית של גרסת מושבה קטנה של Pseudomonas aeruginosa וכימות האלגינט שלה. J. Vis. Exp. (2020)

סרטון זה מדגים בדיקה קולורימטרית לכימות אלגינט המיוצר על ידי Pseudomonas aeruginosa, תוך שימוש בקרבזול לאיתור חומצות אורוניות לאחר הידרוליזה של חומצה. השיטה מאפשרת ניתוח השוואתי של ייצור אלגינט מנורמל לביומסה חיידקית במחקרים ובמחקרים קליניים.

פרוטוקול

1. בדיקת קרבזול חומצה אורונית

1. זהה מושבה בודדת מתרבית טהורה של הזן הרצוי לבדיקה. בעזרת קיסם סטרילי, קוטפים את המושבה ומניחים את הקיסם במבחנה תרבית המכילה 5 מ"ל של מרק בידוד Pseudomonas (PIB). גדל בחממת שייקר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.
   הערה: הזנים הבאים, PAO581 (PAO1mucA25), PAO581carA, PAO581carB ו-PAO581pyrD, גודלו על צלחות PIA (Pseudomonas isolation agar) או לוחות PIA בתוספת 0.1 מ"מ אורציל לקצירת אלגינט למדידה.
2. על צלחת PIA שחוממה מראש הוסיפו 150 מיקרוליטר של ציר PIB מתורבת (לצלחות של 15 מ"מ על 100 מ"מ) או 450 מיקרוליטר של ציר (לצלחות של 15 מ"מ על 150 מ"מ). בעזרת מפזר תאים סטרילי מורחים את המרק על הצלחת. גדל את הצלחת ב-37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.
   הערה: שאפו עודפי נוזלים, אם בכלל, מהצלחת באמצעות פיפטה על ידי הטיית הצלחת לצד אחד. גם לוחות PIB וגם PIA המשמשים בפרוטוקול מכילים 20 מ"ל/ליטר של גליצרול, שהתאים משתמשים בו כמקור פחמן כדי לסייע בייצור אלגינט.
3. בעזרת בקר פיפטה ופיפטה סטרילית של 50 מ"ל, הוסף 0.85% NaCl (נתרן כלורי) לדשא שגדל ואסוף את הדגימה על ידי גירוד הצלחת באמצעות מפזר תאים. שאבו את הדגימה באמצעות פיפטה טרייה של 50 מ"ל לתוך צינור איסוף של 50 מ"ל. מערבל את הדגימה גבוה כדי לערבב ולהניח את הדגימות על קרח.
   הערה: נפח התוספת של 0.85% NaCl משתנה בהתאם לגודל הצלחת. עבור צלחות בגודל 15 מ"מ על 100 מ"מ, השתמש ב-10-30 מ"ל, ועבור צלחות בגודל 15 מ"מ על 150 מ"מ, השתמש ב-20-50 מ"ל.
4. מדוד את הצפיפות האופטית ב-600 ננומטר (OD₆₀₀) של הדגימות על ידי הוספת 1 מ"ל של הדגימה לקובטה חד פעמית וקריאת ה-OD באמצעות ספקטרופוטומטר. חזור על שלב זה פעמיים כדי לקבל שלוש קריאות עבור כל דגימה.
5. הוסף 3 מ"ל מתמיסת החומצה הגופרתית/בוראט לצינורות התרבית ותן לה לשבת על קרח. הוסף 350 מיקרוליטר מהדגימה שנאספה לאט לתערובת החומצה במבחנות ומערבולת נמוכה לזמן קצר.
   1. הכן מלאי בוראט על ידי הוספת 10.099 גרם אבקת אשלגן הידרוקסיד (KOH) ל -45 מ"ל מים. מוסיפים לתערובת 24.74 גרם חומצה בורית (H₃BO₃) ומביאים את הנפח ל -100 מ"ל.
   2. מניחים בקבוק של 1 ליטר בכיור עם קרח וממלאים אותו ב -500 מ"ל חומצה גופרתית מרוכזת. הוסף לאט לאט 15 מ"ל ממלאי הבוראט המוכן. הניחו לבקבוק להתקרר.
   3. הוסף עוד 10 מ"ל של מלאי בוראט לסך של 25 מ"ל. לאחר שהבקבוק מתקרר, הביאו את הנפח ל-1 ליטר.
      זהירות: שיטה זו מסתמכת על שימוש בחומצה גופרתית מרוכזת מאוד. יש להשתמש בציוד מגן אישי מתאים כדי להבטיח בטיחות, ויש לעקוב אחר פרוטוקול הסילוק הנכון עבור הדגימה.
      הערה: לבקרה חיובית, ריכוז ידוע של חומצה D-mannuronic ו/או דגימת אלגינט חיידקית ידועה נקצר ומטוהר באמצעות זנים מייצרי אלגינט של P. aeruginosa (למשל, PAO581-PAO1mucA25). לבקרה שלילית, השתמש בתמיסת NaCl של 0.85% ו/או PAO1ΔalgD (מחיקה בתוך המסגרת של הגן algD שהופכת את החיידקים לבלתי מסוגלים לייצר אלגינט לחלוטין). ניתן ליצור מספר צינורות מכל דגימה כדי להגדיל את מספר החזרות הטכניות כדי לסייע בניתוח סטטיסטי. הכן 3-5 צינורות מכל דגימה.
6. הוסף 100 מיקרוליטר של 0.1% קרבזול בתמיסת אתנול לתערובת החומצה/דגימה. מכסים את הצינור והמערבולת במצב בינוני למשך 5 שניות. מניחים באמבטיה יבשה בחום של 55 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
7. לאחר הדגירה, הסר את הצינורות והמערבולת לזמן קצר גבוה והניח להתקרר במשך 5 דקות.
   הערה: הצבע שייראה יהיה גוון של סגול. הצבע יישאר יציב למדידה למשך 1-2 שעות.
8. קרא את ה-OD₅₃₀ של כל שפופרת על ידי הוספת 1 מ"ל מהתערובת לקובטה נקייה וקריאת ה-OD של הדגימות ב-530 ננומטר בספקטרופוטומטר. השתמש בשפופרת עם 0.85% NaCl כריק בספקטרופוטומטר.
9. הכן עקומה סטנדרטית על ידי מדידת OD₅₃₀ של דילולים סדרתיים של ריכוזים ידועים של חומצה D-Mannuronic (1,024 מיקרוגרם/מ"ל, 512 מיקרוגרם/מ"ל, 256 מיקרוגרם/מ"ל, 128 מיקרוגרם/מ"ל, 64 מיקרוגרם/מ"ל, 32 מיקרוגרם/מ"ל, 16 מיקרוגרם/מ"ל ו-8 מיקרוגרם/מ"ל). חזור על הפעולה פעמיים. חלץ משוואה ליניארית מקריאות אלה.
   הערה: העקומה הסטנדרטית צריכה להיעשות רק פעם אחת. המשוואה הליניארית שחולצה ממנה יכולה לשמש לבדיקה מאוחרת יותר.
   1. חשב את ריכוז האלגינט בכל דגימה באמצעות העקומה הסטנדרטית וחלקו את ריכוז האלגינט מהמשוואה הליניארית ב-OD₆₀₀ כדי לקבל את הכמות הכוללת של אלגינט לכל OD₆₀₀.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Accu Block אמבט יבש דיגיטלי	לבנט	NC0205808	באמצעות פישר סיינטיפיק
ספסל עליון מערבולת-ג'יני 2	תעשיות מדעיות	G560
חומצה בורית	מוצרי מחקר בינלאומיים	10043-35-3
חממת ארונות	VWR	1540
קרבזולה	סיגמא	ג-5132
צינורות צנטריפוגה (50 מ"ל)	פישר סיינטיפיק	05-539-13	באמצעות פישר סיינטיפיק
מבחנות תרבות	פישר סיינטיפיק	14-956-6ד	באמצעות פישר סיינטיפיק
פוליסטירן קובט (1.5 מ"ל)	פישר סיינטיפיק	14955127	באמצעות פישר סיינטיפיק
לולאות חיסון חד פעמיות	פישר סיינטיפיק	22-363-597
נתרן חומצה D-מנורונית	סיגמא אולדריץ'	SMB00280
גליצרול	פישר סיינטיפיק	BP906-5	לביולוגיה מולקולרית
אבקת מי מלח חומצה פוספט (PBS)	סיגמא	עמ' 3813
אגר בידוד פסאודומונס (PIA)	דיפקו	292710	באמצעות פישר סיינטיפיק
מרק בידוד פסאודומונס (PIB)	אלפא ביוסיינסס	עמ' 16-115	באמצעות פישר סיינטיפיק
קיסמים עגולים	יהלום		כל מותג
ספקטרופוטומטר SmartSpec Plus	ביוראד	170-2525	או ספק מועדף
נתרן כלורי (NaCl)	סיגמא	ס-5886
צלחת פטרי סטרילית 100 מ"מ x 15 מ"מ	פישר סיינטיפיק	FB0875713	באמצעות פישר סיינטיפיק
חומצה גופרתית	פישר סיינטיפיק	A298-212	ציון טכני
חומצה גופרתית (2 תמיסות עצירה רגילות)	מערכות מו"פ	DY994