$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. ELISA לכימות אלגינט
1. בעזרת מיקרופיפטה, הוסף 50 מיקרוליטר מהדגימה שנאספה לצלחת לא מטופלת של 96 בארות. הוסף 50 מיקרוליטר של מאגר ציפוי (מאגר קרבונט/ביקרבונט pH 9.6) לבארות. דגרו את הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים.
הערה: לבקרה חיובית, ניתן להשתמש בריכוז ידוע של חומצה D-Mannuronic ו/או זן מייצר אלגינט יציב ידוע (למשל PAO581-PAO1mucA25). לבקרה שלילית, השתמש בתמיסת NaCl של 0.85% ו/או PAO1ΔalgD (מחיקה בתוך המסגרת של הגן algD הופכת את החיידקים לבלתי מסוגלים לייצר אלגינט לחלוטין). ניתן ליצור מספר בארות מכל דגימה כדי להגדיל את מספר החזרות הטכניות כדי לסייע בניתוח סטטיסטי. הכן 3-5 בארות מכל דגימה.
2. בעזרת בקבוק שפריץ, שטפו את בארות הצלחת פעמיים עם 1x מי מלח עם חוצץ פוספט (PBS) עם 0.05% Tween 20 (PBS-T) על ידי מילוי הבארות, ולאחר מכן ניקוזם על ידי היפוך הצלחת.
3. בעזרת מיקרופיפטה, הוסף 200 מיקרוליטר של חיץ חוסם (10% חלב דל שומן ב-PBS-T) לבארות. יש לדגור בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
הערה: עטפו את הצלחת בניילון פרפין או בניילון מכווץ כדי למנוע אידוי במקרר.
4. בעזרת בקבוק שפריץ, שטפו את בארות הצלחת פי 2 עם PBS-T על ידי מילוי הבארות, ולאחר מכן ניקוז אותן על ידי היפוך הצלחת.
5. בעזרת מיקרופיפטה, הוסיפו 100 מיקרוליטר של נוגדן ראשוני מדולל (נוגדן חד שבטי אנטי-אלגינט של עכבר) לבארות ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 1-2 שעות.
הערה: נוגדן ראשוני (נוגדן חד שבטי אנטי-אלגינט לעכבר) סופק בריכוז של 0.5 מיקרוגרם/מ"ל (דילול של 1:2,000 ממלאי 1 מ"ג/מ"ל) בתמיסה מדללת נוגדנים (1% חלב דל שומן ב-1x PBS).
6. בעזרת בקבוק שפריץ, שטפו את בארות הצלחת פי 3 עם PBS-T על ידי מילוי הבארות, ולאחר מכן ניקוז אותן על ידי היפוך הצלחת.
7. בעזרת מיקרופיפטה, מוסיפים 100 מיקרוליטר של נוגדן משני מדולל לבארות ודוגרים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 1-2 שעות.
הערה: נוגדן משני ששימש היה נוגדן פרוקסידאז פולי-חזרת (HRP) נגד עכברים לריכוז של 0.25 מיקרוגרם/מ"ל (דילול של 1:2,000 מתוך מלאי של 0.5 מ"ג/מ"ל) בתמיסת דילול נוגדנים.
8. בעזרת בקבוק שפריץ, שטפו את בארות הצלחת פי 3 עם PBS-T על ידי מילוי הבארות, ולאחר מכן ניקוז אותן על ידי היפוך הצלחת.
9. בעזרת מיקרופיפטה, הוסף 100 מיקרוליטר של תמיסת TMB (3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine)-ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) (טבלת חומרים) ודגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות בחושך.
הערה: הצבע של תגובה חיובית יהיה גוון של כחול.
10. בעזרת מיקרופיפטה מוסיפים 100 מיקרוליטר תמיסת עצירה (2 N חומצה גופרתית).
הערה: הצבע יהפוך מכחול לצהוב כאשר מוסיפים את תמיסת העצירה. הצבע יציב עד 30 דקות לאחר הפסקת התגובה.
11. בעזרת קורא לוחות, קרא את ה-OD ב-450 ננומטר.
12. לייצר עקומה סטנדרטית על ידי מדידת OD450 של דילולים סדרתיים של ריכוזים ידועים של חומצה D-Mannuronic (1,024 מיקרוגרם/מ"ל, 512 מיקרוגרם/מ"ל, 256 מיקרוגרם/מ"ל, 128 מיקרוגרם/מ"ל, 64 מיקרוגרם/מ"ל, 32 מיקרוגרם/מ"ל, 16 מיקרוגרם/מ"ל ו-8 מיקרוגרם/מ"ל). חזור על הפעולה פעמיים. מהקריאות הללו, חלץ משוואה ליניארית.
הערה: העקומה הסטנדרטית צריכה להיעשות פעם אחת בלבד. המשוואה הליניארית שחולצה ממנה יכולה לשמש לבדיקה מאוחרת יותר.
1. חשב את ריכוז האלגינט בכל דגימה באמצעות העקומה הסטנדרטית וחלקו את ריכוז האלגינט מהמשוואה הליניארית ב-OD600 כדי לקבל את הכמות הכוללת של אלגינט לכל OD600.