מידול קולוניזציה של נרתיק עכברים על ידי חיידקים אנאירוביים

תקציר

מקור: Morrill, S. R., et al. מודלים של קולוניזציה נרתיקית של עכברים על ידי חיידקים שגדלו אנאירובית. J. Vis. Exp. (2022)

סרטון זה מדגים פרוטוקול למידול קולוניזציה נרתיקית בעכברים באמצעות חיידקים אנאירוביים עמידים לאנטיביוטיקה. זה מתחיל בטיפול הורמונלי להגברת הרגישות לאפיתל, ואחריו חיסון נרתיקי וחיסון משותף בתנאים אנאירוביים. ההליך מסתיים בדגימה ותרבית לאחר החיסון כדי להעריך את קולוניזציה של חיידקים והיווצרות ביופילם.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים מודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ומועצת הביקורת הווטרינרית של JoVE.

1. הכנת חיסון

הערה: חלק זה מכיל את השלבים הכלליים להכנת חיסון מ-Gardnerella vaginalis JCP8151B-SmR עמיד לסטרפטומיצין שגדל באופן אנארובי. כל השלבים בסעיף זה צריכים להיעשות בתא אנאירובי.

1. מחזור כל ריאגנטים, כולל מרק ניו יורק סיטי III (NYCIII), אגר ותמיסת מלח פוספט (PBS), לתוך תא אנאירובי כדי לאזן לפחות 24 שעות לפני השימוש.
   הערה: כאן נעשה שימוש בתא ויניל אנאירובי מאוזן עם תערובת גז מימן של 5%. ריכוז החמצן הפנימי נשען בדרך כלל על 0 ppm, אם כי יכולות להיות עליות חולפות ברמה נמוכה (10-25 ppm) בעת מחזור חומרים לתוך החדר.
2. יומיים לפני החיסון בנרתיק, פס גרדנרלה ממאגר גליצרול קפוא על צלחת אגר NYC III בתא האנאירובי. השתמש במיכל קטן (כגון קופסת קצה פיפטה ריקה) מלא בקרח יבש כדי לשמור על ציר הגליצרול קפוא במהלך ההובלה פנימה והחוצה מהתא.
3. יום אחד לפני החיסון הנרתיקי, יש להשתמש ב-5-10 מושבות גרדנרלה בודדות מהצלחת כדי לחסן 10 מ"ל של ציר NYC III. אפשר לתרבית הנוזלית לגדול למשך הלילה למשך 16 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. כלול מנה שנייה של 1 מ"ל של מדיום התרבות שנותר לא מחוסן ודגר אותו לצד התרבית המחוסנת כדי לאשר שהמדיום אינו מזוהם.
4. הכן את החיסון מתרבות נוזלית כמתואר להלן. בצע את הכנת החיסון בתא האנאירובי ככל האפשר.
   1. קבע את הצפיפות האופטית של התרבות (OD) על ידי הוספת 200 מיקרוליטר של תרבית ל-800 מיקרוליטר של מדיה טרייה בקובטה של 1.5 מ"ל (דילול 1:5). השתמש בספקטרופוטומטר כדי למדוד את הצפיפות (OD) של התרבית המדוללת באורך גל של 600 ננומטר (השתמש בקובט נפרד עם מדיה טרייה בלבד כריק). הכפל את קריאת ה-OD ב-5 כדי לקבל את ה-OD₆₀₀ בפועל של תרבית 16 שעות.
   2. חשב את נפח החיסון הדרוש לניסוי. לדוגמא, כדי להדביק 15 עכברים בחיסון של 20 מיקרוליטר לעכבר, יש צורך ב-15 x 20 מיקרוליטר = 300 מיקרוליטר חיסון. הכינו כ-25% יותר חיסון מהנדרש, כך שעבור 15 עכברים, הכינו 300 מיקרוליטר + (0.25 x 300 מיקרוליטר) = 375 מיקרוליטר חיסון.
   3. באמצעות ה-OD₆₀₀ שנקבע בשלב 1.4.1, חשב את הנפח של תרבית 16 השעות שצריך לסובב ולהשעות מחדש כדי לקבל חיסון OD₆₀₀ = 5.0 בנפח המחושב בשלב 1.4.2. לדוגמה, אם ה-OD₆₀₀ של התרבית הוא 1.5, ונפח החיסון הדרוש הוא 375 מיקרוליטר, אז נפח התרבית שיש לסובב כלפי מטה הוא (375 מיקרוליטר x 5)/1.5 = 1250 מיקרוליטר.
   4. פיפטה נפח התרבית המחושב בשלב 1.4.3. לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה סטרילי. גלולה את החיידקים על ידי צנטריפוגה ב-16,000 x גרם למשך 1-3 דקות.
   5. הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש את הגלולה ב-PBS אנאירובי בנפח המחושב בשלב 1.4.2. החיסון יהיה כעת ב-OD₆₀₀ מחושב של 5.0. במידת הצורך, הכינו גם שפופרת של PBS שתשמש כבקרת רכב לעכברים בקבוצת הביקורת הלא נגועה.
5. לפני הוצאת צינור החיסון מהתא האנאירובי, הכינו סדרת דילול סדרתי מ-1:10 עד 1:10 x 10⁶ ב-PBS. לוחית ספוט 5 משכפלת כל דילול על צלחת אגר באמצעות פיפט רב-ערוצי כדי לקבוע את היחידות היוצרות מושבה או CFU של החיסון. זהו ה-CFU לפני החיסון.
6. טרום שטיפה נרתיקית וחיסון עם גרדנרלה
   1. הכן שטיפת הנרתיק / צינורות שטיפה בתא האנאירובי. פיפטה 70 מיקרוליטר של PBS סטרילי ואנאירובי לתוך צינורות מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מ"ל המסומנים במספרי עכבר. הכן צינור כביסה אחד לכל עכבר. סגור היטב את הצינורות ומחזור אותם מחוץ לתא האנאירובי.
   2. בצע שטיפת נרתיק על כל עכבר עם PBS אנאירובי של 50 מיקרוליטר מהצינורות הבודדים שהוכנו בשלב 2.1. שטיפות נרתיקיות אלו הן שטיפות לפני החיסון וניתן להשתמש בהן למדידות ובדיקות במורד הזרם.
      1. לאחר מתן הזריקה השנייה של β-אסטרדיול ואלרט, הניחו כל עכבר על גבי כלוב או משטח נקי וקשיח שהוא יכול לאחוז בכפות רגליו הקדמיות. אחזו בעדינות בחלק האמצעי של הזנב והרימו כך שהחלק האחורי מורם מעט ופתח הנרתיק חשוף.
      2. בעזרת פיפטה וקצה מסנן p-200, משוך 50 מיקרוליטר PBS מצינור הכביסה המתאים לעכבר המתאים. הכנס בעדינות את קצה הפיפטה ללומן הנרתיק ~2-3 מ"מ, והכניס את נפח ה-50 מיקרוליטר פנימה והחוצה בעדינות, פי 3-4.
      3. העבירו את חומר הכביסה שנאסף (~50 מיקרוליטר) בחזרה לאותו צינור כביסה שממנו הגיע, תוך פיפטינג למעלה ולמטה בצינור הכביסה שעדיין מכיל את 20 המיקרוליטר הנותרים של PBS. אם יש ריר מוגזם והקצה נסתם, השתמש בקצה p200 נקי כדי לאסוף את החומר הנותר ולהניח אותו באותו צינור כביסה.
   3. יש לתת בנרתיק 20 מיקרוליטר של מתלה החיידקים המרוכז או בקרת הרכב לתוך הנרתיק של כל עכבר. לחסן כל עכבר מיד לאחר שטיפת הנרתיק עבור אותו עכבר (כלומר, לבצע שטיפה וחיסון ברצף עבור כל עכבר לפני המעבר להבא). כדי לפשט את התהליך הזה, השתמשו בשתי פיפטות p200 - האחת מוגדרת ל-50 מיקרוליטר לשטיפות והשנייה ל-20 מיקרוליטר לחיסונים.
      1. רסן את העכבר כמתואר בשלב 2.2.1. בעזרת קצה p-200, פיפטה 20 מיקרוליטר של תרחיף חיידקים לתוך הנרתיק. עבור ניסויי חיסון משותף באמצעות שני זנים/זני חיידקים שונים, השתמש ב-10 מיקרוליטר מכל תרחיף חיידקים והימנע מערבוב שני הזנים לפני החיסון.
         הערה: נפח החיסון הכולל לא יעלה על 20 מיקרוליטר כדי למנוע זליגה מהנרתיק.
      2. המשך להחזיק את הקצה האחורי של כל עכבר למשך 10-20 שניות כדי למנוע מהנפח הניתן להצטבר מיד בכניסה לנרתיק. לאחר מכן, הניחו את העכבר בכלוב/כלי קיבול חדשים או עם חברים לכלוב שכבר חוסנו.
      3. חזור על שלב 2.2. ושלב 2.3. עבור כל עכבר. לעולם אל תחזיר עכברים לכלוב עם בעלי חיים שעדיין לא חוסנו. זה מונע חשיפה לא מכוונת של עכברים לחיידקים עמידים לסטרפטומיצין לפני החיסון.
   4. לאחר שכל העכברים חוסנו, מחזור את צינור החיסון בחזרה לתוך החדר האנאירובי. הכן וצלחת דילול סדרתי נוסף כמתואר בשלב 1.5. זהו ה-CFU שלאחר החיסון. השווה את ה-CFUs מהלוחות שלאחר החיסון ולפני החיסון כדי לקבוע אם הכדאיות של החיסון ירדה כשהוא מחוץ לתא האנאירובי במהלך חיסון בעלי החיים.
   5. צלחת את שטיפות הנרתיק שנאספו בשלב 2.2. על אגר סלקטיבי (במקרה זה, 1 מ"ג/מ"ל סטרפטומיצין). דגרו את הצלחות למשך 1-2 ימים בתא אנאירובי בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ובדקו אם יש צמיחה. הערה: צמיחה מצביעה על כך שחברים אנדוגניים במיקרוביום עמידים לסמן הברירה ולכן עשויים, לפיכך, לטשטש את ספירת ה-CFU של אורגניזם המטרה.
7. אוסף שטיפות נרתיקיות לקביעת קולוניזציה בת קיימא של גרדנרלה
   1. אסוף את שטיפות הנרתיק בנקודות זמן נבחרות כדי לנתח קולוניזציה בנרתיק. איסוף כמתואר בשלב 2.2.
   2. מיד לאחר האיסוף, מחזור את שטיפת הנרתיק לחדר אנאירובי. השתמש ב-10 מיקרוליטר מכל שטיפה כדי לבצע דילול וציפוי סדרתי על אגר סלקטיבי כמתואר בשלב 1.5. השתמש בספירת ה-CFU כמדד להתיישבות הנרתיק על ידי גרדנרלה (או אנאירובה אחרת מעניינת).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
β-אסטרדיול 17-ואלרט	סיגמא	E1631	אסטרוגניזציה של עכברים
1x PBS	פישר	MT21040CM	שטיפת הנרתיק, G. vaginlalis Inoculum Prep, איסוף רקמות והומוגניזציה
תא אנאירובי	קוי	7200000	גידול חיידקים אנאירוביים
בקטו אגר	פישר	DF0140074	G. vaginalis, F. nucleatum ו-P. bivia agar plates
גלוקוז	סיגמא	G7528	מדיה בניו יורק לצמיחת G. vaginalis
הפס	סלגרו	25-060-קל'	מדיה בניו יורק לצמיחת G. vaginalis
סרום לסוסים	המוסטט	ש"ח 500	מדיה בניו יורק לצמיחת G. vaginalis
תערובת גזי מימן (5% מימן, 10% CO₂, 85% חנקן)	מת'סון		גז לתא אנאירובי
מטהר מים Milli-Q	מיליפור	מנת משכל -7000	ליצירת מדיה והומוגניזציה
NaCl	סיגמא	S3014	מדיה בניו יורק לצמיחת G. vaginalis
גז חנקן	איירגז		גז לתא אנאירובי
טיפים לסינון P-200	ביוגרפיה של ISC	פ-1237-200	שטיפות בנרתיק וחיסוני חיידקים
שמן שומשום	פישר	ICN15662191	אסטרוגניזציה של עכברים
ספקטרופוטומטר	ביוכרום	80-3000-45	מדידת OD חיידקי ₆₀₀
סטרפטומיצין	ג'יבקו	11860038	הוסף ל-Agar Media ליצירת צלחות סלקטיביות
תמצית שמרים	פישר	DF0127-17-9	מדיה בניו יורק לצמיחת G. vaginalis