בדיקת שיטפון שתילים לבדיקת עמידות חיידקים בעגבניות

תקציר

מקור: חסן, ג'יי.א., ואח'. זיהוי תפוקה גבוהה של עמידות ל-Pseudomonas syringae pv. עגבנייה בעגבנייה באמצעות בדיקת שיטפון שתילים. J. Vis. Exp. (2020).

סרטון זה מדגים שיטה לסינון עמידות חיידקים בזני עגבניות שונים באמצעות שתילים בני עשרה ימים המחוסנים בתרחיף חיידקים. הוא מסביר כיצד חיידקים פולשים דרך פיוניות, מספקים חלבונים אפקטורים לדיכוי חסינות הצמח, וכיצד תגובות הצמח שונות בין זנים רגישים ועמידים. התוצאה מוערכת על ידי התבוננות בהבדלי צמיחה גלויים, כאשר צמחים עמידים נשארים בריאים ורגישים מראים נזק לרקמות.

פרוטוקול

1. שיטת הצפה של שתילי עגבניות

1. הוציאו את הצלחות עם השתילים בני 10 ימים מתא הגידול והכניסו לארון הבטיחות הביולוגית כדי להכין את הצלחות להצפה.
2. הסר את סרט הניתוח משתי צלחות.
3. הגדר טיימר למשך 3 דקות. מדוד 6 מ"ל של החיסון הסופי של P. syringae pv. עגבנייה (Pst) (Pst19 OD₆₀₀ = 0.0075 או PstDC3000 OD₆₀₀ = 0.005) ולהעביר 6 מ"ל חיסון לכל צלחת עם השתילים בני 10 ימים.
4. דחף בעדינות את השתילים כלפי מטה לתוך החיסון בעזרת קצה פיפטה סטרילי. הפעל את הטיימר.
5. החזיקו צלחת אחת בכל יד. הטה את החלק הקדמי של הצלחת כלפי מטה כדי לצבור חיסון ובעיקר להטביע את הקוטילדון והעלים של השתילים.
6. יש להחליק מצד לצד 5-7x ואז להטות את הצלחות לאחור כדי לכסות את השורשים ואת כל הצלחת.
7. הטה את הצלחות כלפי מטה שוב כדי להטביע את הקוטילדון והעלים, וחזור על הפעולה למשך 3 דקות בסך הכל.
8. יוצקים את החיסון מהצלחות, מניחים את הצלחות על משטח ישר ואז שופכים את כל החיסון שנותר בפעם השנייה.
9. עטפו מחדש את הצלחות בסרט כירורגי וחזרו על שלבים 1.2-1.8 עבור כל הצלחות שנותרו.
10. דגרו מחדש את הלוחות בתא הגידול לאחר שכל הלוחות הוצפו.

פנוטיפ לאחר 7-10 ימים עבור PstDC3000 או 10-14 ימים עבור Pst19.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
ארון בטיחות ביולוגית, סוג II סוג A2
קוביות פלסטיק חד פעמיות למותג, פוליסטירן	VWR בינלאומי	47744-642
קיסמי עץ שטוחים של Chenille Kraft	VWR בינלאומי	500029-808
פתיל מבער אלכוהול מזכוכית	פישר סיינטיפיק	S41898A / לא. W-125
מבערי אלכוהול מזכוכית	פישר סיינטיפיק	S41898 / מס' BO125
מגיב גליצרול ACS	VWR בינלאומי	EMGX0185-5
קימברלי-קלארק™ Kimtech Science™ Kimwipes™ מגבי משימות עדינים	פישר סיינטיפיק	06-666-א
מגנזיום כלוריד, בדרגת ACS	VWR בינלאומי	97061-356
מגנזיום גופרתי הפטהידרט, בדרגת ACS	VWR בינלאומי	97062-130
צינורות מיקרוצנטריפוגה, 1.5 מ"ל
צינורות מיקרוצנטריפוגה, 2.2 מ"ל
Murashige & Skoog, מלחי בסיס	מעבדות קייסון בע"מ	MSP01-50LT
פיפט-לייט XLS LTS 8-CH פיפט 20-200uL	ריינין	L8-200XLS
פיפט-לייט XLS LTS 8-CH פיפט 2-20uL	ריינין	L8-20XLS
צלחת פטרי סטרילית מפוליסטירן 100 מ"מ על 25 מ"מ	VWR בינלאומי	89107-632
צלחת פטרי סטרילית מפוליסטירן 150 מ"מ על 15 מ"מ	פישר סיינטיפיק	FB08-757-14
צלחת פטרי סטרילית מפוליסטירן 150x15 מ"מ	פישר סיינטיפיק	08-757-148
טיפים LTS 20 μL 960/10 GPS-L10	ריינין	17005091
טיפים LTS 250 מיקרוליטר 960/10 GPS-L250	ריינין	17005093