אספקה מקומית של חיידקים ללומן המעי של זחל דג זברה באמצעות מיקרו-הזרקה

תקציר

מקור: Li, J. et al. פיתוח מודל זיהום של דג זברה זחל עבור Clostridioides difficile. J. Vis. Exp. (2020)

סרטון זה מדגים את האספקה המבוססת על מיקרו-הזרקה של Clostridioides difficile המסומן פלואורסצנטי ללומן המעי של זחל דג זברה מורדם. הוא מתאר את השלבים הכרוכים בהכנת זחלים, הזרקת חיידקים ואישור מבוסס מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של לוקליזציה של חיידקים במעי.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים מודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ומועצת הביקורת הווטרינרית של JoVE.

1. הזרקת Clostridioides difficile מוכתמים לזחלי דג הזברה

1. יש להרדים 20-30 זחלי דג זברה 5 ימים לאחר ההפריה (המכונה כאן 5 dpf) עם 0.02%-0.04% טריקאין (אבקת טריקאין מומסת במים מזוקקים כפולים ומותאמת ל-pH = 7 עם תמיסת Tris-HCL של 1 M) ב-30% מדיום של דניאו ~10 דקות לפני ההזרקה. מעבירים את הזחלים המורדמים לצלחת פטרי טרייה בגודל 10 ס"מ ומסירים את כל 30% המדיום העודף של דניו.
2. מניחים טיפה של 0.8% אגרוז נמס נמוך על זחלי דג הזברה לכיסוי. התאם בעדינות את הזחלים למצב רוחבי. מניחים את צלחת הפטרי על קרח למשך 30-60 שניות כדי לאפשר לאגרוז הנמס נמוך להתמצק. הוסף 30% מדיום של Danieau המכיל 0.02%-0.04% טריקאין כדי לכסות את האגרוז.
3. הכן את תמיסת ההזרקה. הוסף 1 מיקרוליטר של 0.5% פנול אדום בתמיסת מלח עם חוצץ פוספט (PBS) לתוך 9 מיקרוליטר של חיסון Clostridioides difficile המוכתם בצבע כדי לדמיין את תהליך ההזרקה.
4. טען מחט מיקרו-הזרקה מכוילת עם תמיסת ההזרקה באמצעות מיקרו-טוען. התקן את המחט הטעונה על מיקרומניפולטור ומקם אותה מתחת לסטריאומיקרוסקופ.
5. כוונן את לחץ ההזרקה בין 600-900 hPa. הגדר את זמן ההזרקה ל-0.1-0.3 שניות כדי לקבל 0.5-1.0 nL. הגדר את המחט במיקרומניפולטור בזווית של ~45° המצביעה לכיוון הזחלים המוטבעים.
6. הנח את קצה המחט מעל מערכת העיכול, קרוב לנקבוביות האורוגניטליות. חודרים דרך אגרוז, ואז את השריר עם קצה המחט, ואז מכניסים אותו ללומן המעי ומזריקים 0.5-1.0 nL של Clostridioides difficile. השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לנטר את הזחלים המוזרקים ולאסוף את הזחלים שהוזרקו כהלכה להדמיה קונפוקלית.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
אגרוז נמס נמוך (LM)	פרונדיסה	8050	הוא משמש בצלחות אגרוז
כתם חיידקי אדום BacLight	תרמו פישר סיינטיפיק	B35001	צבע פלואורסצנטי
זכוכית נימית	מנגנון הרווארד	30-0019	מחטי הזרקה
קלוסטרידיואידס דיפיצילה			R20291, זן ריבוטייפ 027, ייצור TcdA+/TcdB+/CDT+
DMSO	קארל רוט בע"מ	א994
פיג׳י	פלטפורמת קוד פתוח		עיבוד תמונה
מזרק מיקרו	אפנדורף	5253000017
מיקרוסקופ קונפוקלי Leica SP8	לייקה
פנול אדום	סיגמא-אולדריץ'	עמ' 0290
טריקאין	סיגמא-אולדריץ'	E10521