בידוד ותרבית של חיידקי Clostridioides difficile ממעי זחל דג הזברה

תקציר

מקור: Li, J., et al., פיתוח מודל זיהום של דג זברה זחל עבור Clostridioides difficile. J. Vis. Exp. (2020)

סרטון זה מדגים את הבידוד והתרבות של חיידקי Clostridioides difficile מהמעי של דג הזברה הזחל. המעי הנגוע מנותח, הומוגני ומודגר במדיה אנאירובית סלקטיבית המכילה אנטיביוטיקה. תנאים אלה מדכאים חיידקים מתחרים ומקדמים צמיחה של תאים ברי קיימא.

פרוטוקול

דיסקציה של מעי דג הזברה של הזחל כדי לשחזר קלוסטרידיואידס דיפיצילה בר-קיימא

1. בודד את דרכי העיכול מזחלים כדי לנתח את העומס החיידקי. התחל בהמתת חסד של זחלי דג הזברה עם 0.4% טריקאין.
2. שוטפים את דג הזברה לזמן קצר עם 1x PBS סטרילי (מי מלח עם פוספט) ומעבירים אותם לצלחת אגרוז טרייה.
3. דיסקציה של דג הזברה
   1. הכנס מחט לתוך תא המטען הגבי של זחלי דג הזברה קרוב לראש כדי לשתק את דג הזברה. הסר את הראש מאחורי הזימים בעזרת רומח.
   2. הכנס את המחט השנייה לאמצע תא המטען הגבי הכנס את המחט השלישית לבטן של דג הזברה ומשוך את המעי החוצה מחלל הגוף.
      הערה: יש צורך בזהירות יתרה כדי לבודד את המעי השלם. אם קשה לעשות זאת, בצע משיכות נוספות כדי להפריד את שאר המעי משאר האיברים הפנימיים הנותרים.
   3. השתמש במחט מיקרו-הזרקה כדי להעביר 10-15 מעיים לתוך צינור של 1.5 מ"ל המכיל 200 מיקרוליטר סטרילי 1x PBS.
   4. הומוגניזציה של המעיים בעזרת עלי כדי לשבש את הרקמה ולהכין הומוגנטים. ודא שהעלי מגיע לתחתית הצינור כדי לשבש לחלוטין את כל המעיים.
4. דגירה על ההומוגנטים במדיום גידול C. difficile המכיל D-ציקלוסרין וצפוקסיטין, עם או בלי טאורוכולט (TCA, נבט של נבגי C. difficile ) בתא אנאירובי.
5. דגרו את הצלחת באופן אנאירובי למשך 48 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.

חומרים