תחייה וצמיחה של חיידקי חומצה לקטית

תקציר

מקור: Ayivi, R. et al., הטיפוח, הצמיחה והכדאיות של חיידקי חומצה לקטית: נקודת מבט של בקרת איכות. J. Vis. Exp. (2022)

סרטון זה מדגים את השיטה לשחזור חיידקי חומצה לקטית בלחץ קר ממאגר גליצרול קפוא, שחזור כדאיות חיידקים באמצעות דגירה אנאירובית ובידוד מושבות פעילות להרחבת תרבית.

פרוטוקול

1. פרוטוקול להפעלה ובקרת איכות של תרביות חיידקי חומצה לקטית (LAB)

1. קח את מלאי הגליצרול המוכן של זני LAB (בצינורות צנטריפוגה של 2 מ"ל) מהמקפיא הנמוך במיוחד של -80 מעלות צלזיוס, ואל תאפשר להם להפשיר לפני השימוש.
2. יש לנקות ולחטא את פתח צינורות הצנטריפוגה ב-70% אלכוהול, ומערבולת בעדינות לפני השימוש.
3. פיפטה כ-250 מיקרוליטר (0.25 מ"ל) מתרבית ה-LAB מהמלאי מצינורות הצנטריפוגה למבחנות טריות של 2 מ"ל MRS (דה-מן, רוגוסה ושארפ).
4. מערבל בעדינות את המבחנות ודגירה אנארובית למשך הלילה בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס למשך 12-16 שעות.
5. קח כ-500 מיקרוליטר (0.5 מ"ל) מהתרביות שגדלו במהלך הלילה ממבחנות MRS של 2 מ"ל לתוך מבחנות MRS טריות של 7 מ"ל, מערבולת, ודגר אותן באופן אנאירובי למשך הלילה בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס למשך 12-16 שעות.
6. העריכו את הגידול המיקרוביאלי על ידי מדידת הצפיפות האופטית (OD) או הצמיחה של התרביות ב-610 ננומטר עם ספקטרופוטומטר גלוי UV ורישום תוצאות מקובלות בין 0.7 ל-0.9.
7. פס את תרביות הלילה מצינורות MRS של 7 מ"ל על לוחות אגר MRS ו-MRCM-PYR (מדיום פירובט קלוסטרידיאלי מחוזק שונה) ודגר אותם באופן אנאירובי למשך 72 שעות ב-42 מעלות צלזיוס.
8. מושבות מבודדות נקטפות מלוחות האגר, מועברות למבחנות MRS טריות של 7 מ"ל, מערבולות בעדינות ומודגרות באופן אנאירובי למשך הלילה בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס למשך 12-16 שעות.
9. אחסן את צלחות האגר המכילות את הזנים המבודדים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס במקרר למשך שבוע.
10. מדוד ואשר את ה-OD (בין 0.7 ל-0.9) ממבחנות MRS של 7 מ"ל של תרביות ה-LAB שבודדו מהלוחות המפוספסים ב-610 ננומטר והשתמש בהם כתרביות עבודה לכל הניסויים הקשורים.
11. כדי להשיג יחס של 1:10, בצע דילול פי עשרה (דילולים סדרתיים) של תרביות ה-LAB הגדלות ממבחנות MRS הסופיות של 7 מ"ל תוך שימוש ב-9 מ"ל מי פפטון (מאגר פיזיולוגי).
12. לבסוף, קח כ-250 מיקרוליטר (0.25 מ"ל) מדילולים סדרתיים מתאימים לכל ניסויי התסיסה.
13. הפעל את המרק המכיל זנים (250 מיקרוליטר) משלב 2.12 על ידי העברתם למרק MRS טרי של 7 מ"ל ודגירה אנאירובית בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות.
    הערה: כל זני ה-L. bulgaricus הופעלו במרק ה-MRS הטרי שהוכן ולאחר מכן הודגרו באופן אנאירובי בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות על מנת להגיע לצפיפות אופטית (OD₆₁₀ ננומטר) של גידול חיידקים בין 0.7 ל-0.9. צמיחת חיידקים נמדדה באמצעות ספקטרופוטומטר גלוי UV ב-610 ננומטר. ערכי ה-pH של תרביות הלילה היו בטווח של 3.5 עד 5.3 כתוצאה מייצור חומצה לקטית, תוצר סופי אורגני של תסיסה LAB. נהלי בטיחות כגון זרימת אוויר נכונה במכסה המנוע והימנעות מכוויות במהלך השימוש במבער בונסן נשמרו ונצפו.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
כחול אנילין	תרמו סיינטיפיק	₪21526	25 גרם
תמצית בקר	מוצרי מחקר בינלאומיים	50-197-7509	500 גרם
תמצית שמרים	פישר סיינטיפיק	BP1422-500	500 גרם
סידן כלוריד דיהידראט	פישר סיינטיפיק	C79-500	500 גרם
דקסטרוז נטול מים	פישר סיינטיפיק	BP350500	500 גרם
D-פרוקטוז	אקרוס אורגניקס	AC161355000	500 גרם
אבקת אגר Difco	דיפקו	DF0812-07-1	2 ק"ג
אגר TPY	דיפקו	211921	500 גרם
צינור מיקרוצנטריפוגה אפנדורף (נעילה בטוחה של מיקרוצנטריפוגה Snap-Cap)	פישר סיינטיפיק	05-402-12	2 מ"ל
גליצרול	תרמו סיינטיפיק	PI17904	500 מ"ל
אינפורמטור CO₂ אינפרא אדום	פורמה סיינטיפיק
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus	אוסף תרבות הסוג האמריקאי (ATCC)	ATCC 11842
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus	בולגריה	S9
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus	בולגריה	ליב6
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus	המעבדה למיקרוביולוגיה וביוטכנולוגיה של מזון (NCATSU)	DAW
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus	המעבדה למיקרוביולוגיה וביוטכנולוגיה של מזון (NCATSU)	ה22
לקטובצילוס ראוטרי	ביוגאי, ראלי / המעבדה למיקרוביולוגיה וביוטכנולוגיה של מזון (NCATSU)	RD2
L-ציסטאין הידרוכלוריד מונוהידראט	סיגמא-אולדריץ'	C6852-25G	25 גרם
מלטוז מונוהידראט	פישר סיינטיפיק	M75-100	100 גרם
מרק MRS	ניאוגן	50-201-5691	5 ק"ג
פפטון מס' 3	האך	50-199-6719	500 גרם
אשלגן פוספט דו-בסיסי (K₂HPO₄)	מוצרי מחקר בינלאומיים	50-712-761	500 גרם
נתרן אצטט טריהידרט	פישר סיינטיפיק	S220-1	1 ק"ג
נתרן כלורי	פישר סיינטיפיק	BP358-1	1 ק"ג
נתרן פירובט	פישר סיינטיפיק	BP356-100	100 גרם
מבחנות עם מכסי בורג מרופדים בגומי	פישר סיינטיפיק	FB70125150	25 x 150 מ"מ
טווין 80	פישר סיינטיפיק	T164-500	500 מ"ל
מקפיא נמוך במיוחד	כל כך נמוך
אורסיל	אקרוס אורגניקס	AC157301000	100 גרם
ספקטרופוטומטר גלוי UV	תרמו פישר סיינטיפיק	אבולוציה 201
מערבולת ג'יני 2	פישר סיינטיפיק
תמצית שמרים	פישר סיינטיפיק	BP1422-500	500 גרם
אתנול	פישר סיינטיפיק	T08204K7	4 ליטר
חומצה הידרוכלורית (6N (מאושרת), פישר כימיקלים)	פישר סיינטיפיק	SA56-500	500 מ"ל