זיהוי תפוקה גבוהה של פולימרים דוחי חיידקים באמצעות סינון מיקרו-מערך

תקציר

מקור: Venkateswaran, S., et al. זיהוי תפוקה גבוהה של פולימרים דוחי חיידקים עבור מכשירים רפואיים. J. Vis. Exp. (2016)

סרטון זה מדגים שיטה בעלת תפוקה גבוהה לזיהוי פולימרים דוחי חיידקים באמצעות שקופית מיקרו-מערך החשופה לתרביות חיידקים מעורבות. קשירת חיידקים מוערכת על ידי פלואורסצנטיות DAPI, כאשר אות מופחת מצביע על פולימרים עם חיבור מינימלי של פני השטח.

פרוטוקול

1. חיסון של מיקרו-מערכי פולימרים עם חיידקים

הערה: הקפידו על טכניקה אספטית טובה. כל הטיפול בתרבויות צריך להתבצע בסביבה סטרילית: באמצעות מבער בונסן או במכסה המנוע. יש לגדל תרביות עם זמינות חמצן, מדיום גידול וטמפרטורה המותאמים לדרישות של כל מין.

1. הכינו תרביות לילה על ידי חיסון 5 מ"ל ציר לוריא-ברטאני (LB: 10 גרם/ליטר בקטו-טריפטון, 5 גרם/ליטר נתרן כלורי, NaCl ו-10 גרם/ליטר תמצית שמרים) עם מושבה מצלחת. דגירה למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס, רעידה ב-200 סל"ד (סיבובים לדקה).
2. מכינים מלאי מקפיא של תרביות לילה בתוספת גליצרול (ריכוז כולל של 10%) ומאחסנים את הציר בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
3. על מנת לקבוע את מספרי התאים מדגימות של מלאי החיידקים המופשרים, בצע דילול סדרתי של כל מלאי וגדל את החיידקים בן לילה על מצע מוצק. קביעה מדויקת של מספר התאים במלאי מבטיחה חיסון מתאים של כל מין.
4. הכן חיסון למיקרו-מערך. תרביות של מין יחיד גדלות כאמור לעיל ומיושמות ישירות על המיקרו-מערכים. BacMix-1 הוא תערובת חיידקים של Klebsiella pneumoniae (K. pneumoniae), Staphylococcus saprophyticus (S. saprophyticus) ו-Staphylococcus aureus (S. aureus). BacMix-2 היא תערובת חיידקים המורכבת מ-Streptococcus mutans (S. mutans), S. aureus, K. pneumoniae ו-Enterococcus faecalis (E. faecalis).
5. כדי לייצר תרביות מעורבות, ערבבו למשך הלילה בנפחים שווים (3 מ"ל כל אחד) ודללו ארבע פעמים עם LB טרי (עד כ-50 מ"ל נפח סופי).
6. מניחים מיקרו-מערכי פולימר מעוקרים אולטרה סגול בצלחות מלבניות של 4 בארות ודוגרים עליהם עם 6 מ"ל של תרביות חיידקים מעורבות ב-37 מעלות צלזיוס עם תסיסה עדינה (30 סל"ד) למשך 5 ימים.
7. לאחר הדגירה, יש לשטוף בעדינות את המיקרו-מערכים פעמיים עם מי מלח עם חוצץ פוספט (PBS: 137 מ"מ NaCl, 2.7 מ"מ אשלגן כלורי, KCl, 10 מ"מ דיסודיום מימן פוספט, Na₂HPO₄, 1.8 מ"מ אשלגן דימימן פוספט, KH₂PO₄) ולדגור עם תמיסה של 1 מיקרוגרם/מ"ל של כתם 4',6-דיאמידינו-2-פנילינדול (DAPI) ב-PBS למשך 30 דקות.
8. שטפו את שקופיות המיקרו-מערך המוכתמות בצלחת באר טרייה על ידי כיסוי ב-PBS וערבוב עדין, החלפת ה-PBS פעם אחת. יבש תחת זרימת אוויר. מרחו החלקה של כיסוי זכוכית על שקופית המיקרו-מערך ואטמו במקומה עם דבק. לאחר הייבוש, יש לעקר את המשטח החיצוני עם אתנול 70% (v/v).
9. השלך בבטחה תרבויות בהתאם לרמת ההכלה שלהן.

2. הדמיה וניתוח מיקרו-מערך

1. צלם תמונות בודדות עבור כל נקודת פולימר בערוצי שדה בהיר ו-DAPI (עירור/פליטה, Ex/Em = 358 ננומטר / 361 ננומטר). בצע זאת באופן ידני עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי או באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי אוטומטי (עם שלב XYZ הנשלט על ידי תוכנת רכישת תמונה) המצויד במטרה פי 20.
   הערה: כוונן את המיקרוסקופ כדי לקבל תמונות באמצעות ערוצי שדה בהיר ו-DAPI. ודא שזמן הרווח והחשיפה לצילום תמונה עבור כל המיקרו-מערכים זהים.
2. השג את עוצמת הקרינה הממוצעת של כל נקודה בערוץ DAPI על ידי בחירת אזור הנקודה וכימות הקרינה באמצעות תוכנת עיבוד תמונה.
3. עבור הקרינה הרקע של כל נקודה, השג תמונות של כתמי הפולימר על מיקרו-מערך משוכפל המודגר רק עם מדיה ללא חיידקים. הפחת את הקרינה ברקע מעוצמת הנקודה כדי לקבל פלואורסצנטיות מחיידקים.
4. חשב את הערך המנורמל הממוצע מארבעת הנקודות, המייצגות כל פולימר, המשמש להשוואת קשירת חיידקים של פולימרים שונים.
5. זהה את הפולימרים המציגים את הקישור החיידקי הנמוך ביותר (הקרינה הנמוכה ביותר) כפולימרים 'פגיעה'.

חומרים