בידוד חיידקים עמידים לאנטיביוטיקה מדגימת מים לאנליזה מולקולרית

תקציר

מקור: Ghadigaonkar, D. and Rath, A. בידוד וזיהוי של חיידקים עמידים לאנטיביוטיקה הנישאים במים ואפיון מולקולרי של הגנים העמידים לאנטיביוטיקה שלהם. J. Vis. Exp. (2023)

סרטון זה מדגים את הבידוד וההכנה של חיידקים עמידים לאנטיביוטיקה מדגימת מים באמצעות מדיה סלקטיבית. ה-DNA מופק מחיידקים עמידים לאנטיביוטיקה ומוגבר כדי לזהות את הגנים העמידים לאנטיביוטיקה של החיידקים.

פרוטוקול

1. איסוף ועיבוד דגימות

1. איסוף דוגמאות
   1. אסוף את הנפח המתאים של דגימת המים במיכלי דגימה סטריליים, וודא שלא יותר מ-3/4 מהמיכל מלא.
   2. הובלת הדגימות למעבדה בתנאים אספטיים בהקדם האפשרי לאחר האיסוף ועיבוד מיידי.
2. עיבוד מדגם
   1. סנן אספטית את דגימת המים דרך מטלית מוסלין סטרילית כדי להסיר כל חומר חלקיקי.
   2. בצע דילולים סדרתיים מתאימים של המים המסוננים להמשך ניתוח.

2. הערכת העומס החיידקי הכולל וספירת החיידקים העמידים לאנטיביוטיקה

1. קביעת העומס החיידקי הכולל
   1. השעו 18.12 גרם של אבקת אגר 2A (אגר R2A) של Reasoner ב-1,000 מ"ל מים מזוקקים כפולים והמיסו את התערובת על ידי חימום. חיטוי התערובת המומסת ב-121 מעלות צלזיוס, 15 פאונד לאינץ' מרובע (psi) למשך 20 דקות. הכן צלחות R2A Agar Modified על ידי יציקת הכמות המתאימה של התערובת החיטוי לתוך צלחות פטרי סטריליות (למשל, הוסף כ-20 מ"ל של מדיום סטרילי חיטוי לצלחת פטרי סטרילית של 90 מ"מ).
   2. לאחר שהמדיום מתמצק, יש לפזר באופן שווה 100 מיקרוליטר מהדילולים המתאימים של דגימת המים המסוננים על צלחת R2A Agar, Moded. בצע את הניסוי בשכפול.
   3. דגרו את כל הלוחות הנ"ל בטמפרטורה של 35 - 37 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות (שנה את הטמפרטורה וזמן הדגירה בהתאם למדיה המשמשת לבידוד).
   4. בטא את העומס החיידקי הכולל במונחים של יחידות יוצרות מושבה למיליליטר (CFU/mL) באמצעות משוואה (1):
2. קביעת ספירת חיידקי AR
   1. בצע את שלבים 2.1.1-2.1.4. עם זאת, במקום אגר R2A, צלחות מותאמות, השתמש ב-R2A Agar, צלחות מותאמות בתוספת אינדיבידואלית של חמש אנטיביוטיקות שונות, כלומר צפוטקסים (3 מיקרוגרם/מ"ל), ציפרופלוקסצין (0.5 מיקרוגרם/מ"ל), אריתרומיצין (20 מיקרוגרם/מ"ל), קנמיצין (15 מיקרוגרם/מ"ל) וונקומיצין (3 מיקרוגרם/מ"ל).
   2. הוסף את האנטיביוטיקה בנפרד לתוך צינורות המכילים 20 מ"ל של אגר R2A מותך סטרילי, מותאם (עם הטמפרטורה של אגר R2A מותך, שונה ב-≤40 מעלות צלזיוס) כדי להשיג את ריכוז האנטיביוטיקה הסופי כפי שהוזכר בשלב 2.2.1.
   3. מערבבים לערבוב אחיד ויוצקים על צלחות פטרי סטריליות לפני שהאגר מתמצק. בצע את הניסוי בשכפול.
   4. דגרו את כל הצלחות הנ"ל בטמפרטורה של 35 - 37 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות (הטמפרטורה וזמן הדגירה עשויים להשתנות אם משתמשים במדיה אחרת).
   5. לבקרת איכות ובדיקת יעילות האנטיביוטיקה, יש לפזר 100 מיקרוליטר של תרחיפי חיידקים של זני Escherichia coli ATCC 25922 ו-Staphylococcus aureus ATCC 29213 על לוחות R2A Agar המכילים אנטיביוטיקה בהתאמה (ודא שצפיפות התרבית הטרייה המשמשת לחיסון היא צפיפות אופטית, OD = 0.5 ב-600 ננומטר).
   6. קבע את ספירת החיידקים העמידים לאנטיביוטיקה במונחים של CFU/mL כמתואר בשלב 2.1.4.

3. זיהוי חיידקים הניתנים לתרבות על ידי ריצוף גנים 16S ribosomal RNA (rRNA)

1. הכנת תבנית DNA מהמבודדים לתגובת שרשרת פולימראז (PCR)
   1. בעזרת קיסם סטרילי, קחו מושבה אחת, מבודדת וטהורה של המבודד הגדל על צלחת פטרי. השעו את מושבת החיידקים ב-100 מיקרוליטר מים סטריליים מזוקקים כפולים בצינור מיקרו-צנטריפוגה סטרילי והרתיחו במשך 10 דקות.
   2. צנטריפוגה את התרחיף ב-10,000 × גרם למשך 2 דקות כדי לגלול את הפסולת, ולהעביר את הסופרנטנט לצינור מיקרו-צנטריפוגה סטרילי טרי לשימוש כתבנית ה-DNA הגולמי.
2. הגברת PCR ממוקדת של אזור V3 של הגן 16S rRNA וריצוף
   1. הכן 40 מיקרוליטר מתערובת התגובה בצינור PCR להגברת PCR, כפי שהוזכר בטבלה 1.
      הערה: הכנת ה-DNA צריכה להתבצע על גוש קרח תוך מזעור הסיכוי לזיהום (ללבוש כפפות בזמן הטיפול בריאגנטים, ולנקות את משטח העבודה ביסודיות עם 70% אתנול).
   2. הנח את הצינור בבלוק התרמי, והפעל את התוכנית המתאימה במחזור התרמי PCR. ראה טבלה 2 לתנאי מחזור ה-PCR הסטנדרטיים ומידע הפריימר להגברה של אזורי V3 של הגנים 16S rRNA.

טבלה 1: מרכיבי PCR mastermix. הרכב תערובת התגובה של ריאגנטים שונים של PCR.

ריאגנטים PCR	נפח (μL)
2x טאק מאסטר מיקס	20
פריימר קדמי (10 שומות פיקו)	1.5
פריימר הפוך (10 שומות פיקו)	1.5
תבנית DNA גולמית	1.5
ביולוגיה מולקולרית סטרילית מים	15.5
נפח כולל	40

 

 

 

 

 

 

 

טבלה 2: תנאי מחזור PCR להגברה של הגן 16S rRNA. מוצגים תנאי מחזור ה-PCR הנדרשים להגברת גן 16S rRNA. השלבים כוללים שלב דנטורציה ראשוני, ואחריו 35 מחזורים של דנטורציה, חישול והארכה, ושלב הארכה אחרון.

כיוון	רצף פריימר 5' - 3'	תנאי PCR	לא. של מחזורים
קדימה	GGAGGCAGCAGTAAGGAAT	94 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות	1
		דנטורציה ב-94 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות	35
		חישול ב-50 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות
		הארכה ב-72 מעלות צלזיוס למשך 40 שניות
הפוך	CTACCGGGGTATCTAATCC	הארכה סופית ב-72 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות	1

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
2x PCR Taq מאסטרמיקס	היימדיה	MBT061-50R	להכנת תערובת תגובת PCR
אינקובטור 37 מעלות צלזיוס	GS-192, Gayatri Scientific	נה	לדגירה של חיידקים
אוטוקלאב	אקווטרון	נה	נדרש לעיקור מדיה, לוחות זכוכית, מבחנות וכו'
ארון Bisafety B2	אימסט	IMSET BSC-Class II סוג B2	משמש לעבודה מיקרוביולוגית כמו תרבות חיידקים, AST וכו '.
אבקת אנטיביוטיקה Cefotaxime	היימדיה	TC352-5G	להכנת תמיסת מלאי אנטיביוטיקה הנדרשת במהלך בידוד חיידקים עמידים לאנטיביוטיקה
מיניספין צנטריפוגה	אפנדורף	מיניספין פלוס-5453	משמש לכדור הפסולת במהלך הכנת DNA גולמי
אבקת אנטיביוטיקה ציפרופלוקסצין	היימדיה	TC447-5G	להכנת תמיסת מלאי אנטיביוטיקה הנדרשת במהלך בידוד חיידקים עמידים לאנטיביוטיקה
קולורימטר	החיפוש	נה	לבדיקת OD של תרחיפי תרבות
חממת שייקר קירור	BTL41 אלייד סיינטיפיק	נה	לדגירה של לוחות מדיה לטיפוח חיידקים
אבקת אנטיביוטיקה אריתרומיצין	היימדיה	CMS528-1G	להכנת תמיסת מלאי אנטיביוטיקה הנדרשת במהלך בידוד חיידקים עמידים לאנטיביוטיקה
אבקת אנטיביוטיקה אריתרומיצין	היימדיה	TC024-5G	להכנת תמיסת מלאי אנטיביוטיקה הנדרשת במהלך בידוד חיידקים עמידים לאנטיביוטיקה
אבקת אנטיביוטיקה של קנמיצין	היימדיה	MB105-5G	להכנת תמיסת מלאי אנטיביוטיקה הנדרשת במהלך בידוד חיידקים עמידים לאנטיביוטיקה
מרק לוריא ברטאני	היימדיה	M1245-500G	להעשרת תרבויות
R2A אגר, שונה	היימדיה	M1743	להכנת לוחות מדיה לבידוד עומס חיידקי כולל ועמיד לאנטיביוטיקה (AR)
נתרן כלורי	היימדיה	TC046-500G	להכנת תמיסת מלח 0.85% לדילול סדרתי של דגימת המים
Staphylococcus aureus subsp. aureus ATCC 29213	היימדיה	0365פ	משמש כפקד בעת ביצוע AST
אבקת אנטיביוטיקה ונקומיצין	היימדיה	CMS217	להכנת תמיסת מלאי אנטיביוטיקה הנדרשת במהלך בידוד חיידקים עמידים לאנטיביוטיקה
איזון שקילה	מטלר טולדו	ME204 מטלר טולדו	משמש לשקילת אבקות מדיה, אבקות ריאגנטים וכו'.