מערכת גידול משותף לחקר התגובות המולקולריות של מארחי צמחים וחיידקים המקיימים אינטראקציה

תקציר

מקור: Nathoo, N., et al. מערכת גידול משותף הידרופונית לניתוח סימולטני ושיטתי של אינטראקציות ואיתות מולקולריות של צמח/חיידק. J. Vis. Exp. (2017).

סרטון זה מדגים מערכת גידול משותף הידרופונית לחקר אינטראקציות בין צמחים לחיידקים בתנאים סטריליים. שתילי צמחים מועברים למצע גידול סטרילי וחומצי, מודגרים ונבדקים לאיתור זיהום לפני החיסון באגרובקטריום. החיידקים הפעילים נצמדים לשורשי הצמח, מעבירים T-DNA לתאי הצמח ומקדמים שינויים מולקולריים המשפרים את ההתיישבות של החיידקים.

פרוטוקול

1. מערכת גידול משותף הידרופונית

1. הכן מדיום נוזלי Murashige ו-Skoog (MS): 2.165 גרם/ליטר מלחי בסיס MS, 10 גרם/ליטר סוכרוז, 0.25 גרם/ליטר 2-(N-מורפולינו)חומצה אתנסולפונית (MES), ו-59 מ"ל/ליטר תערובת ויטמינים B5, pH 5.75.
2. חיטוי המדיום. יוצקים 18 מ"ל ממנו לכל זכוכית גלילית סטרילית או מיכל פלסטיק שקוף (כלים מתגבשים, 100 על 80 מ"מ) עם מכסים סטריליים.
   הערה: עקרו מראש את המיכלים והמכסים על ידי עטיפתם בנייר אלומיניום וחיטוי.
3. בקולט אדים מעוקר, השתמשו במלקחיים סטריליים כדי להעביר בעדינות כל ריבוע רשת עם שתילים בני 10-14 יום מהמדיום המוצק למחצה למיכל גלילי הידרופוני (איור 1d). אטום את המכסים על המיכלים באמצעות סרט כירורגי נקבובי.
4. טפחו את השתילים על הרשת במיכל למשך 72 שעות בטמפרטורה של 22-24 מעלות צלזיוס, עם תקופת אור של 16 שעות וניעור ב -50 סל"ד לאוורור (איור 1 ה).
   הערה: זה מאפשר לצמחים להסתגל לסביבה ההידרופונית לפני החיסון (גידול משותף) עם מיקרואורגניזמים. תקופת המתנה זו תאפשר גם זיהום מיקרוביאלי מקרי לפני החיסון.
   1. התחל את השלב הבא יום לפני תום תקופת הדגירה.
5. לגדל Agrobacterium tumefaciens במדיום אגרובקטריום (AB) (0.5% w/v תמצית שמרים, 0.5% w/v טריפטון, 0.5% w/v סוכרוז, 50 מ"מ MgSO₄, pH 7.0) ב-28 מעלות צלזיוס עם ניעור למשך הלילה עד שהתרבית מגיעה לצפיפות אופטית סופית של 1.0 ב-600 ננומטר (OD₆₀₀), כפי שנמדד באמצעות ספקטרופוטומטר, עם מדיום AB לא מחוסן כריק.
   הערה: OD₆₀₀ של 1.0 שווה ערך לכ-10⁹ תאים/מ"ל.
6. שטפו את ה- A. tumefaciens שלוש פעמים בנפח שווה של 0.85% NaCl. השעו בנפח שווה של מים מזוקקים כפולים סטריליים.
7. לפני החיסון, בדוק היטב את המיכל עם שתילים כדי לוודא שאין זיהום; המדיום במיכלים הלא מזוהמים צריך להיות שקוף ושקוף.
   1. השליכו כל מיכל עם נוזל מעונן (זיהום) ומספרו את שאר המיכלים. דגימו כמות קטנה (20 מיקרוליטר) של מדיום הידרופוני מכל מיכל ממוספר ואתרו אותו על צלחת פטרי מלאה במרק לוריא (LB). דוגרים את המנה בחום של 28 מעלות צלזיוס.
8. מיד, הוסף 50 מיקרוליטר של תרחיף A. tumefaciens (כ-5 x 10⁷ תאים, מוערך מ-OD₆₀₀) לכל מיכל הידרופוני ממוספר. לטפח במשותף את שתילי Arabidopsis thaliana ו- A. tumefaciens בטמפרטורה של 22-24 מעלות צלזיוס עם תקופת אור של 16 שעות ורעידות ב -50 סל"ד (איור 3f).
   1. בדוק את לוחית ה-LB המנומרת משלב 1.7.1. לאחר דגירה של 12 ו -28 שעות כדי לוודא את סטריליות המיכלים. אם יש זיהום כלשהו, אל תשתמש במיכל הממוספר המתאים (מחוסן בחיידקים) לבדיקות נוספות במורד הזרם.
9. אם תרצה, עקוב אחר הצמיחה של A. tumefaciens במרווחי זמן קבועים על ידי הוצאת דגימה של מדיום מהמיכל ומדידת ה-OD₆₀₀ באמצעות ספקטרופוטומטר עם מדיום מבקרה לא מחוסנת כריק (איור 2).
   הערה: תסמינים של מחלות צמחים אמורים להופיע אחרי 7 ימים (איור 3).

תוצאות

איור 1: מערכת גידול משותף של צמח-מיקרוב הידרופוני. הפאנל השמאלי מייצג תרשים זרימה המתאר את ששת השלבים העיקריים בהרכבה ותפעול של מערכת הגידול המשותף ההידרופוני. הפאנל הימני מדגים את חומרי הניסוי, הציוד והנהלים התפעוליים בפועל עבור מערכת הגידול ה...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
זרעי צמחים (Arabidopsis thaliana Col-0)	מרכז המשאבים הביולוגיים ארבידופסיס	CS7000	https://abrc.osu.edu/order-stocks
חיידקים (Agrobacterium tumefaciens C58)	אוניברסיטת וושינגטון	לא ישים
חיידקים מסומנים	בתוך החברה		אופציונלי, תלוי בניתוחים במורד הזרם
מים מזוקקים כפולים	(שונות)
מיקרופיפטה	(שונות)
מלחי בסיס Murashige ו-Skoog (MS)	סיגמא-אולדריץ'	M5524
סוכרוז	(שונות)
MES	(שונות)
תערובת ויטמינים B5	סיגמא-אולדריץ'	G1019
פיטואגר	(שונות)
צלחות פטרי עמוקות	(שונות)
רשת נירוסטה	חברת מוצרי חוט מעבורת בע"מ	לא ישים	כיתה: 304; ספירת רשתות: 40 × 40; חוט DIA: 0.01
סרט מיקרופור, 1 אינץ'	3 דקות	1530-1
תא גידול יומי	(שונות)
מיכלי זכוכית גליליים, 100 × 80 מ"מ	פיירקס	3250	ניתן להשתמש בגדלים אחרים, ובמקרה זה ייתכן שיהיה צורך להתאים את תכולת הנוזל
מכסה מנוע זרימה	(שונות)
מלקחיים	(שונות)
תמצית שמרים	(שונות)
טריפטון	(שונות)
MgSO₄	(שונות)
אינקובטור רועד	(שונות)