הכנת ספרופלסט E. coli

תקציר

מקור: Figueroa, D. M., et.al. ייצור והדמיה של ספרופלסטים ופרוטופלסטים חיידקיים לאפיון לוקליזציה של פפטידים אנטי-מיקרוביאליים. J. Vis. Exp. (2018)

סרטון זה מדגים את הייצור של ספרופלסטים Escherichia coli על ידי עיכוב חלוקת התאים כדי לגרום לנימה, ולאחר מכן עיכול אנזימטי של דופן התא. התהליך כולל הוספה מבוקרת של חומר כלאט, DNase ומייצב אוסמוטי כדי להבטיח היווצרות ויציבות תקינה של ספרופלסט לתצפית מיקרוסקופית.

פרוטוקול

1. הכנת פתרון

1. הכן 1 M Tris-Cl, pH 7.8 על ידי המסת 10.34 גרם Tris HCl ו-4.17 גרם Tris OH ב-50 מ"ל של dH₂O בבקבוק של 125 מ"ל. יש לעקר על ידי סינון דרך מסנן מזרק 25 מ"מ עם קרום של 0.2 מיקרומטר ולאחסן בצינור חרוטי בטמפרטורת החדר.
2. הכן תמיסה A (20 מ"מ MgCl₂, 0.7 מ' סוכרוז, 10 מ"מ Tris-Cl, pH 7.8) על ידי המסת 0.10 גרם MgCl₂ (95.2 גרם/מול) ו-11.98 גרם סוכרוז (342.3 גרם/מול) ב-25 מ"ל dH₂O בבקבוק של 125 מ"ל. הוסף 500 מיקרוליטר 1 M Tris-Cl (pH 7.8) והתאם את עוצמת הקול ל-50 מ"ל. יש לעקר על ידי סינון דרך מסנן מזרק 25 מ"מ עם קרום של 0.2 מיקרומטר ולאחסן בצינור חרוטי בטמפרטורת החדר.
3. הכן תמיסה B (10 מ"מ MgCl₂, 0.8 מ' סוכרוז, 10 מ"מ Tris-Cl, pH 7.8) על ידי המסת 0.05 גרם MgCl₂ (95.2 גרם/מול) ו-13.69 גרם סוכרוז (342.3 גרם/מול) ב-25 מ"ל dH₂O בבקבוק של 125 מ"ל. הוסף 500 מיקרוליטר 1 M Tris-Cl (pH 7.8) והתאם את עוצמת הקול ל-50 מ"ל. יש לעקר על ידי סינון דרך מסנן מזרק 25 מ"מ עם קרום של 0.2 מיקרומטר ולאחסן בצינור חרוטי בטמפרטורת החדר.
4. הכן 0.8 M סוכרוז על ידי המסת 13.69 גרם סוכרוז (342.3 גרם/מול) ב-50 מ"ל dH₂O בבקבוק של 125 מ"ל. יש לעקר על ידי סינון דרך מסנן מזרק 25 מ"מ עם קרום של 0.2 מיקרומטר ולאחסן בצינור חרוטי בטמפרטורת החדר.
5. הכן 5 מ"ג/מ"ל דאוקסיריבונוקלאז I (DNase I) על ידי המסת 0.015 גרם DNase I ב-3 מ"ל של dH₂O בבקבוק של 50 מ"ל. עיקור על ידי סינון דרך פילטר מזרק 25 מ"מ עם קרום של 0.2 מיקרומטר. תמיסת Aliquot לתוך צינורות מיקרופוגה ואחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
6. הכן 0.125 M חומצה אתילנדיאמינטטראצטית (EDTA), pH 8.0 על ידי המסת 0.698 גרם דיסודיום מיובש EDTA (372.2 גרם/מול) ל-15 מ"ל dH₂O בבקבוק של 125 מ"ל. יש לעקר על ידי סינון דרך מסנן מזרק 25 מ"מ עם קרום של 0.2 מיקרומטר ולאחסן בצינור חרוטי בטמפרטורת החדר.
7. הכן 600 מיקרוגרם/מ"ל צפלקסין על ידי המסת 0.03 גרם צפלקסין הידרט (365.404 גרם/מול) ב-50 מ"ל של dH₂O בבקבוק של 125 מ"ל. יש לעקר על ידי סינון דרך מסנן מזרק 25 מ"מ עם ממברנה של 0.2 מיקרומטר ולאחסן בצינור חרוטי בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
8. הכן ליזוזים של 5 מ"ג/מ"ל על ידי המסת ליזוזים של 0.015 גרם ב-3 מ"ל של dH₂O בבקבוק של 50 מ"ל. עיקור על ידי סינון דרך פילטר מזרק 25 מ"מ עם קרום של 0.2 מיקרומטר. תמיסת Aliquot לתוך צינורות מיקרופוגה ואחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
9. הכינו 3% w/v מרק סויה טריפטיקז (TSB) על ידי המסת 30 גרם TSB ב-1 ליטר של dH₂O בבקבוק של 2 ליטר. יש לחלק את התמיסה לצלוחיות המכילות 25 מ"ל או 100 מ"ל TSB לשימוש בהכנת ספרופלסטים של E. coli . צלוחיות חיטוי לעיקור המדיום הנוזלי. ניתן לאחסן TSB סטרילי בטמפרטורת החדר או ב-4 מעלות צלזיוס.

2. הכנת תרבית לילה

הערה: בצע את סעיפים 2-3 בטכניקות סטריליות מתאימות. אם תרצה, זן חיידקי יכול להכיל פלסמיד לעמידות לאנטיביוטיקה כדי להפחית את הזיהום הפוטנציאלי. אם אתם משתמשים בזן עם עמידות לאנטיביוטיקה, הוסיפו את האנטיביוטיקה הדרושה בשלבים 2.1 ו-3.1-3.2.

1. הכן תרבית לילה על ידי בחירת מושבה בודדת של חיידקים באמצעות קצה פיפטה סטרילי והנחתה לתוך צינור תרבית של 14 מ"ל המכיל 2-3 מ"ל של 3% w/v TSB. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, תוך כדי ניעור במשך 16-21 שעות.

3. הכנת ספרופלסטים גראם שליליים E. coli

1. בבקבוק של 250 מ"ל יש לדלל את תרבית הלילה 1:100 בנפח של 25 מ"ל של 3% w/v TSB ולדגור על תמיסת החיידקים ב-37 מעלות צלזיוס, תוך ניעור במשך כ-2.5 שעות עד שהתמיסה הגיעה לצפיפות אופטית של 0.5-0.8 ב-600 ננומטר. מדוד את הצפיפות האופטית באמצעות ספקטרופוטומטר.
2. בבקבוק של 250 מ"ל, יש לדלל את התרבית הזו ב-1:10 ב-30 מ"ל של 3% משקל/נפח TSB ולדגור ב-37 מעלות צלזיוס, תוך כדי ניעור במשך 2.5 שעות בנוכחות 60 מיקרוגרם/מ"ל צפלקסין (347.4 גרם/מול) כדי לייצר חוטי תא בודדים באורך של כ-50-150 מיקרומטר, שניתן לצפות בהם בהגדלה של פי 1,000 באמצעות מיקרוסקופ אור (איור 1B).
3. קצרו את החוטים על ידי צנטריפוגה של תמיסת החיידקים בטמפרטורה של 1,500 x גרם, 4 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות. רוקנים וזורקים את הסופרנטנט, שומרים את הגלולה.
4. שטפו את החוטים על ידי הוספת 1 מ"ל בעדינות של 0.8 מ' סוכרוז, והקפידו לא להפריע לגלולה. דגירה למשך דקה אחת, ולאחר מכן השליכו את הסופרנטנט מבלי להפריע לגלולה.
5. הוסף לגלולה 150 מיקרוליטר של 1 M Tris-Cl (pH 7.8), 120 מיקרוליטר של 5 מ"ג/מ"ל ליזוזים, 30 מיקרוליטר של 5 מ"ג/מ"ל DNase I ו-120 מיקרוליטר של 0.125 M EDTA בסדר המתאים שלהם ולדגור את התמיסה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
6. הוסף 1 מ"ל של תמיסה A בהדרגה במשך דקה אחת לתמיסה שהוכנה תוך 3.5 באמצעות מיקרופיפטה תוך כדי סיבוב עדין של התמיסה ביד. דגרו את התמיסה למשך 4 דקות בטמפרטורת החדר.
7. הכניסו 7 מ"ל של תמיסה B של 4 מעלות צלזיוס לשני צינורות חרוטיים של 15 מ"ל. הוסף כמויות שוות של התמיסה שהוכנה ב -3.6 לכל אחד משני הצינורות הללו. צנטריפוגה את התמיסה ב-1,500 x גרם, 4 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות.
8. בעזרת פיפטה סרולוגית, הסר בזהירות את כל הסופרנטנט מלבד 1-2 מ"ל מבלי להפריע לגלולה. השעו מחדש את הגלולה על ידי פיפטינג בעדינות למעלה ולמטה באמצעות מיקרופיפטה P1000. בדקו ויזואלית כדי לראות היווצרות ספרופלסטים על ידי התבוננות בדגימה בהגדלה של פי 1,000 באמצעות מיקרוסקופ אור (איור 1C).
9. אחסן את הספרופלסטים בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס עד שבוע או עד שהם עברו 3 מחזורי הקפאה-הפשרה.

תוצאות

איור 1: תמונות מייצגות של E. coli. (A) חיידקי E. coli (B) נחש E. coli ו-(C) E. coli spheroplast. התמונות צולמו בהגדלה של פי 100.

חומרים