יצירת פרוטופלסטים מהחיידק הגרם חיובי Bacillus megaterium

תקציר

מקור: Figueroa, D. M., et al. ייצור והדמיה של ספרופלסטים ופרוטופלסטים חיידקיים לאפיון לוקליזציה של פפטידים אנטי-מיקרוביאליים. J. Vis. Exp. (2018)

סרטון זה מדגים הליך שלב אחר שלב ליצירת פרוטופלסטים מהחיידק הגרם חיובי Bacillus megaterium.

פרוטוקול

1. הכנת פתרון

1. הכן ליזוזים של 5 מ"ג/מ"ל על ידי המסת ליזוזים של 0.015 גרם ב-3 מ"ל של dH₂O בבקבוק של 50 מ"ל. עיקור על ידי סינון דרך פילטר מזרק 25 מ"מ עם קרום של 0.2 מיקרומטר. תמיסת Aliquot לתוך צינורות מיקרופוגה ואחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
2. הכינו 3% w/v מרק סויה טריפטיקז (TSB) על ידי המסת 30 גרם TSB ב-1 ליטר של dH₂O בבקבוק של 2 ליטר. יש לצרף את התמיסה לצלוחיות המכילות 100 מ"ל TSB לשימוש בהכנת פרוטופלסטים של B. megaterium . צלוחיות חיטוי לעיקור המדיום הנוזלי. ניתן לאחסן TSB סטרילי בטמפרטורת החדר או ב-4 מעלות צלזיוס.
3. הכן תמיסה C (1 מ' סוכרוז, 0.04 מ' מלאט, 0.04 מ' מ"ג₂, pH 6.5) על ידי המסת 34.23 גרם סוכרוז (342.3 גרם/מול), 0.46 גרם חומצה מאלית (116.07 גרם/מול) ו-0.38 גרם MgCl₂ (95.21 גרם/מול) ב-100 מ"ל של dH₂O בבקבוק של 250 מ"ל. התאם את ה-pH ל-6.5. יש לעקר על ידי סינון דרך מסנן מזרק 25 מ"מ עם קרום של 0.2 מיקרומטר ולאחסן בצינור חרוטי בטמפרטורת החדר.
4. הכן מדיום פרוטופלסט של 200 מ"ל על ידי ערבוב של 100 מ"ל 3% w/v TSB ותמיסה C של 100 מ"ל בבקבוק זכוכית של 1 ליטר. חיטוי לעיקור התמיסה ולאחסון בטמפרטורת החדר.

2. הכנת פרוטופלסטים גראם חיוביים של B. megaterium

1. בבקבוק של 250 מ"ל, יש לדלל את תרבית הלילה 1:1,000 ב-100 מ"ל של 3% w/v TSB ולדגור את תמיסת החיידקים ב-37 מעלות צלזיוס, תוך ניעור במשך כ-4.5 שעות עד שהתמיסה הגיעה לצפיפות אופטית של 0.9-1.0 ב-600 ננומטר. מדוד את הצפיפות האופטית באמצעות ספקטרופוטומטר.
2. יוצקים את התרבית הנוזלית לשני צינורות חרוטיים של 50 מ"ל וצנטריפוגה בטמפרטורה של 2,000 x גרם, 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
3. בעזרת פיפטה סרולוגית, השליכו את הסופרנטנט משני הצינורות החרוטיים. השעו מחדש כל כדור במדיום פרוטופלסט של 2.5 מ"ל ושלבו את התמיסות התלויות לצינור חרוטי יחיד. פיפטה את התמיסה המרחפת המשולבת לבקבוק של 125 מ"ל.
4. מוסיפים 1 מ"ל של 5 מ"ג/מ"ל ליזוזים ודוגרים למשך שעה ב-37 מעלות צלזיוס, תוך כדי ניעור.
5. עקבו אחר הגדילה של פרוטופלסטים בהגדלה של פי 1,000 באמצעות מיקרוסקופ אור, ושימו לב לאי-סדרים, כמו למשל חיידקים שמופיעים כמוטות נפוחים במקום ככדורים (איור 1). בעזרת פיפטה סרולוגית, העבירו את התמיסה לצינור חרוטי של 15 מ"ל וצנטריפוגה בטמפרטורה של 2,000 x גרם, 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
6. שפכו את הסופרנטנט ותלו מחדש את הגלולה במדיה של 5 מ"ל פרוטופלסט. אחסן פרוטופלסטים בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס עד שבוע או עד שהם עברו 3 מחזורי הקפאה-הפשרה.

תוצאות

איור 1: תמונות מייצגות של B. megaterium. (A) חיידקי B. megaterium ו-(B) B. megaterium protoplast. התמונות צולמו בהגדלה של פי 100

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מגנזיום כלוריד	סיגמא	M8266
סוכרוז	סיגמא	S7903
ליזוזים	סיגמא	L6876
מרק סויה BBL Trypticase	פישר סיינטיפיק	B11768
חומצה מאלית	סיגמא	M0375
מסנן מזרק Acrodisc 25 מ"מ עם 0.2 מיקרומטר HT Tuffryn Membrane	תאגיד פאל	4192