הערכת טרנסציטוזיס של E. coli על פני חד-שכבות אפיתל במעי

תקציר

מקור: Islam, A., et al., הערכת טרנסציטוזיס במעי של מבודדי בקטרמיה של Escherichia coli בילודים. J. Vis. Exp. (2023)

סרטון זה מדגים את ההליך להערכת טרנסציטוזיס של Escherichia coli בילודים על פני חד-שכבות אפיתל במעי באמצעות תוספות טרנסוול, מדידת התנגדות חשמלית וכימות חיידקים.

פרוטוקול

1. חיסון התאים (תחילת הניסוי)

1. לאחר שעתיים בדיוק, הוציאו את תרביות חיידקי הבוקר מהשייקר וצנטריפוגה למשך 10 דקות (1,900 x גרם, 4 מעלות צלזיוס).
   הערה: עבור כל השלבים הבאים, שמור את כל תרחיפי החיידקים על קרח כדי למזער את הצמיחה.
2. השהה מחדש את כדור החיידקים במדיום תרבית הרקמה (TCM) ללא אנטיביוטיקה. השתמש בספקטרופוטומטר כדי להתאים את הצפיפות האופטית (OD) ל-0.7-0.9, ולדלל עוד יותר עם TCM ללא אנטיביוטיקה לריכוז של 1 x 10⁶ יחידות יוצרות מושבה (CFU)/מ"ל (דילול של כ-1:100). השתמש בתרחיף חיידקי זה כדי להדביק כל תוספת ב-1 x 10⁵ CFU לכל נפח של 100 מיקרוליטר.
3. סמן את צלחת הטרנסוול והדביק כל תוספת ב-100 מיקרוליטר של החיסון המותאם ל-OD (סה"כ 1 x 10⁵ CFU לכל תוספת). הבדיקה החלה כעת. שימו לב לשעה ורשמו אותה כ-t = 0 שעות.
4. צלחת את תרחיף חיידקי החיסון כדי לכמת את ה-CFU/mL בשיטת דילול המסלול, ציפוי של 10 מיקרוליטר על לוחות אגר LB מרובעים.

2. כימות טרנסציטוזיס

1. כל 30 דקות לאחר החיסון, מלאו בארות חדשות ב-500 מיקרוליטר של TCM ללא אנטיביוטיקה. העבירו את התוספות לבארות החדשות הללו באמצעות סט שונה של מלקחיים סטריליים לכל זן חיידקים שונה.
2. אסוף את המדיה מבאר האיסוף המשומשת עבור כל תוספת לצינורות מסומנים נפרדים. הניחו את הצינורות הללו על קרח. בין נקודות זמן, החזר את לוחות הטרנסוול לחממה.
3. עבור כל תוספת, שלב את המדיה שנאספה מ- t = 0.5 שעות, t = 1 שעות, t = 1.5 שעות ו- t = 2 שעות, ומערבולת בקצרה. צלח את המדיה שנאספה על לוחות אגר לוריא-ברטאני (LB) בשיטת דילול המסלול כדי לכמת את כמות החיידקים שהועברו טרנסציטוזה בשעתיים הראשונות של הניסוי.
   הערה: החזרת החיידקים כל 30 דקות והשארתם על קרח ממזערת את צמיחת החיידקים בבארות האיסוף, והמדידות נעשות בעיקר על חיידקי טרנסציטוזיס.
4. הנח את צלחות האגר LB דילול המסילה המסומנות בחממת החיידקים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ללא תוספת CO₂, והחזר את צלחת הטרנסוול T84 לחממת תרבית הרקמות.
5. ב- t = 4 שעות, חזור על שלב 2.3 על ידי שילוב המדיה שנאספה מ- t = 2.5 שעות, t = 3 שעות, t = 3.5 שעות ו- t = 4 שעות.
6. ב- t = 6 שעות, חזור על שלב 2.3 על ידי שילוב המדיה שנאספה מ- t = 4.5 שעות, t = 5 שעות, t = 5.5 שעות ו- t = 6 שעות. בנוסף, ב-t = 6 שעות, צלחת את המדיה מבארות הבקרה.

3. סוף הניסוי

1. מדוד ורשום את ההתנגדות החשמלית הטרנס-אפיתליאלית (TEER) בסוף הניסוי, t = 6 שעות.
2. לטהר את הגשושית על ידי טבילתה ב-70% אתנול למשך 10-15 דקות. אם תרצה, השלך את התוספות או שמור/עבד אותן ליישומים נוספים. אפשר לצלחות האגר LB לדגור למשך הלילה, ולחטא ו/או להשליך בבטחה את כל החומרים המשומשים האחרים.
3. לאחר דגירה של לילה, ספרו את מושבות החיידקים באופן ידני על צלחות LB של דילול המסלול כדי לקבוע את כמות החיסון ואת כמות הטרנסציטוזיס של E. coli . ודא שלוחות הבקרה אינם מראים צמיחת חיידקים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
צינורות חרוטיים סטריליים 15 מ"ל	מידשי	ג15ב
צינורות מיקרו-צנטריפוגה 2 מ"ל	שיצורה	AVSS2000
צינורות חרוטיים מפוליפרופילן סטריליים 50 מ"ל	בז	352070
צנטריפוגה	סורבאל	אגדה RT
לולאות חיסון חד פעמיות	פישרברנד	22363605
מדיום הנשר השונה של דולבקו (DMEM)	ג'יבקו	11965-084
מד וולט/אוהם אפיתל	מכשירי דיוק עולמיים	EVOM
שייקר אינקובטור	ניו ברונסוויק	אינובה 4080
חממות	תרמו סיינטיפיק	51030284	שלושה מהם משמשים בשיטה: אחד לתרבית רקמות סטריליות, אחד לתרבית רקמות נגועות ואחד לדגירת חיידקים.
מרק ליזוגני	דיפקו	244610
אגר מרק ליזוגני	אי.בי.אי סיינטיפיק	IB49101
ספקטרופוטומטר	יוניקו	1100RS
T84 תאי מעיים	אוסף תרביות רקמות אמריקאיות	CCL248
מוסיף תרבית רקמות, עם קרום פוליאתילן טרפתלט, נקבוביות 3 מיקרומטר, פורמט 24 בארות	בז	353096
צלחת תרבית רקמות, 24 בארות	בז	353504