הכנה ואינדוקציה של תרביות Borrelia burgdorferi לייצור חלקיקים נגיפיים

תקציר

מקור: Eggers, C. H. מניפולציה גנטית בתיווך פאג'ים של מחלת ליים Spirochete Borrelia burgdorferi. J. Vis. Exp. (2022)

סרטון זה מדגים את הכנת תרבית Borrelia burgdorferi מהונדסת גנטית עם DNA בקטריופאג'י רדום הנושא גן עמידות לאנטיביוטיקה. לאחר בחירת אנטיביוטיקה ודגירה, גורם כימי מעורר נזק ל-DNA, מה שמוביל לכריתה, שכפול והרכבה של נגיפים חדשים המכילים את גן העמידות. לאחר צנטריפוגה שנייה והשעיה מחדש, תאי החיידקים המכילים חלקיקים נגיפיים בוגרים מוכנים ליישומים במורד הזרם.

פרוטוקול

1. הכנת תרבית B. burgdorferi לייצור φBB-1

1. הכינו מדיום Barbour-Stoenner-Kelly בתוספת סרום ארנב רגיל (BSK) 6.6% מומת בחום. עבור 1 ליטר של 1x BSK, שלב את הרכיבים המפורטים בטבלה 1 ב-900 מ"ל מים, התאם את ה-pH ל-7.6 באמצעות 1 N נתרן הידרוקסיד, וערבב לאט ב-4 מעלות צלזיוס למשך 2-4 שעות. לאחר השלמת הערבוב, בדוק והתאם מחדש את ה-pH ל-7.6 במידת הצורך, והגדל את הנפח ל-1 ליטר עם מים. עקר את המדיום על ידי מעבר דרך מסנן של 0.22 מיקרומטר (ראה טבלת חומרים) והשתמש טרי או אחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך ≤חודשיים.
2. שלושה עד חמישה ימים לפני תחילת פרוטוקול ההתמרה, יש לחסן 150 מיקרוליטר של שיבוט B....

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
יחידות סינון 1 ליטר (PES, גודל נקבוביות 0.22 מיקרומטר)	מיליפור סיגמא	S2GPU10RE
צינור 12 מ"מ x 75 מ"מ (מכסה מיקום כפול) (פוליפרופילן)	ארה"ב סיינטיפיק	1450-0810	מחזיק 4 מ"ל עם נפח ריק נמוך (לאינדוקציה)
צינורות צנטריפוגה חרוטיים 15 מ"ל (פוליפרופילן)	ארה"ב סיינטיפיק	5618-8271
1-מתיל-3-ניטרוזו-ניטרוגואנידין (MNNG)	מיליפור סיגמא		זהירות: מסרטן פוטנציאלי; כבר לא זמין, לא בדקתי תחליף מוצע
פיפטות פסטר בגודל 5.75 אינץ' (זכוכית כותנה/בורוסיליקט/לא סטרילית)	תרמו פישר סיינטיפיק	13-678-8א	חיטוי לפני השימוש
צינורות צנטריפוגה חרוטיים 50 מ"ל (פוליפרופילן)	ארה"ב סיינטיפיק	1500-1211
אתנול מוחלט
בקטו ניאופפטון	ג'יבקו	DF0119-17-9
Bacto TC Yeastolate	ג'יבקו	255772
אלבומין סרום בקר (דרגת החלפת סרום)	מוצרי ג'מיני ביו	700-104פ
CMRL-1066 עם L-גלוטמין (אבקה)	ביולוגי בארה"ב	C5900-01	דרגת תרבית תאים
אריתרומיצין	מוצרי מחקר אינטרנשיונל קורפ	E57000-25.0
פתרון ריאגנט ג'נטמיצין	ג'יבקו	15750-060
גלוקוז (דקסטרוז נטול מים)	תרמו פישר סיינטיפיק	BP350-500
הפס	תרמו פישר סיינטיפיק	BP310-500
קנמיצין סולפט	תרמו פישר סיינטיפיק	25389-94-0
Millex-GS (גודל נקבוביות של 0.22 μM)	מיליפור סיגמא	SLGSM33SS	לסינון, עיקור, אנטיביוטיקה ותמיסות אחרות בנפח קטן
מיטומיצין כ	תרמו פישר סיינטיפיק	BP25312	זהירות: מסרטן פוטנציאלי; השתמש רק במכסה אדים כימי
N-אצטיל-D-גלוקוזאמין	MP ביומדיקלס בע"מ	100068
צלחת פטרי (100 מ"מ × 15 מ"מ)	תרמו פישר סיינטיפיק	FB0875712
סרום ארנב צעיר לא סטרילי עקבות המוליזה (NRS)	פל-פריז ביולוגית	31119-3	השבתת חום לפי הוראות היצרן
נתרן ביקרבונט	תרמו פישר סיינטיפיק	BP328-500
נתרן פירובט	מיליפור סיגמא	P8674-25G
תמיסת סטרפטומיצין סולפט	מיליפור סיגמא	S6501-50G
טריסודיום ציטראט דיהידראט	מיליפור סיגמא	S1804-500G	נתרן ציטראט עבור BSK