זיהוי אנליט מטרה באמצעות חיישן ביולוגי חיידקי

תקציר

מקור: Barber, A. E., et al. הכנה ויישום של חיישן ביולוגי חיידקי חדש לזיהוי משוער של שאריות ירי. J. Vis. Exp. (2019).

סרטון זה מדגים זיהוי של אנליטים ספציפיים באמצעות חיישן ביולוגי חיידקי. נלקחת תרבית חיידקים הנושאת פלסמיד עם גן חלבון פלואורסצנטי אדום (RFP) תחת מקדם רגיש לאנליט. לאחר ניגוב יסודי של משטח הבדיקה, חלק קטן מהמגבון טובל בתרבות ומודגר. האינטראקציה האנליטית עם המקדם מפעילה ביטוי RFP, ומאשרת את נוכחותו של אנליט המטרה.

פרוטוקול

הערה: מוצגת סינתזה של E. coli המבטא חלבון פלואורסצנטי אדום (RFP).

1. הכנת חומצה דאוקסיריבונוקלאית פלסמיד (DNA) מ - E. coli

1. להפשיר E.coli המכיל פלסמיד עם גן RFP וגן עמיד לאמפיצילין, ולגדל את ה-E.coli על לוחות אגר Luria Broth (LB) המכילים 100 מיקרוגרם/מ"ל אמפיצילין ב-37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. לדוגמה, השתמש בפלסמיד J10060 מרישום החלקים הביולוגיים הסטנדרטיים המשמשים לביולוגיה סינתטית (ראה טבלת חומרים). הפלסמיד J10060 כולל גן ל-RFP בשליטה של אזור מקדם pBad וגן עמידות לאמפיצילין. לחלופין, הפוך E.coli (עיין בשלב 3.2) עם הפלסמיד לפני הצמיחה על לוחות אגר LB.
2. עקוב אחר פרוטוקול מיני-הכנה סטנדרטי (ראה טבלת חומרים) כדי לבודד DNA מ-1 מ"ל של תרבית E. coli המכילה את הפלסמיד J10060. מטרת הפרוטוקול הבא היא להסיר את מקדם pBad ולהחליף אותו במקדם הרצוי למכשיר.
3. לאחר מיני-הכנת הפלסמיד, אחסן את ה-DNA במקפיא עד שהוא מוכן לעיכול.

2. עיכול אנזימי הגבלה

1. הגדר את התגובה הבאה בצינור מיקרו-צנטריפוגה לעיכול EcoRI ו-NheI: 10 מיקרוליטר של DNA פלסמיד J10060 (מבודד בשלב 1), 8 מיקרוליטר מים ו-1 מיקרוליטר כל אחד מאנזימי EcoRI ו-NheI מעורבבים מראש עם 1 מיקרוליטר של מאגר (ראה טבלת חומרים).
2. עבור ה-DNA המקדם, הגדר את התגובה הבאה בצינור מיקרו-צנטריפוגה לעיכול EcoRI ו-NheI: 10 מיקרוליטר של רצפי DNA מקדם מחוסל (8 מיקרוליטר מים, ו-1 מיקרוליטר כל אחד מאנזימי EcoRI ו-NheI מעורבבים מראש עם 1 מיקרוליטר של מאגר.
   1. עבור אנטימון (Sb-), עופרת (Pb-) או טריניטרוטולואן (TNT)-RFP (ראה טבלת חומרים), ממיסים את האוליגונוקלאוטידים במאגר (30 מ"מ 4-(2-הידרוקסיאתיל)-1-פיפרזינאתיל-חומצה סולפונית (HEPES), pH 7.5; 100 מ"מ אשלגן אצטט), מדגרים בריכוזים טוחנים שווים, מחממים ל-94 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, ומצננים בהדרגה בטמפרטורת החדר).
3. מערבבים את הדגימות על ידי פיפטה בעדינות למעלה ולמטה כשהפיפטה מכוונת ל-10 מיקרוליטר.
4. יש לדגור למשך 30 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס.
5. השביתו את האנזימים בחום בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
6. אחסנו את הדנ"א המעוכל במקפיא עד שיהיה מוכן לשלב הבא.

3. קשירה וטרנספורמציה

1. קשירה
   1. באמצעות ה-DNA של הפלסמיד והמקדם שעוכלו פעמיים עם EcoRI ו-NheI בשלב 2, הגדר את תערובת התגובה המוצגת בטבלה 1 בצינור מיקרו-צנטריפוגה על קרח; הוסף את ה-T4 DNA Ligase אחרון. הערה: טבלה 1 מציגה קשירה באמצעות יחס מולארי של וקטור 1:3 להכנסה עבור גדלי ה-DNA המצוינים.
   2. מערבבים בעדינות את התגובה על ידי פיפטינג למעלה ולמטה ומיקרוצנטריפוגה קצרה.
   3. דוגרים בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
   4. השבתת חום ב-65 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
2. שינוי
   1. הפשירו צינור עם 20 מיקרוליטר של תאי אי קולי DH5-alpha על הקרח עד שגבישי הקרח האחרונים ייעלמו.
   2. הוסף 5 מיקרוליטר של DNA פלסמיד לתערובת התאים. החלק בזהירות את הצינור 4-5 פעמים כדי לערבב את התאים וה- DNA.
   3. מניחים את התערובת על קרח למשך 2 דקות.
   4. הלם חום ב-42 מעלות צלזיוס בדיוק למשך 30 שניות בדיוק. אין לערבב.
   5. מניחים על קרח למשך 2 דקות. אין לערבב.
   6. פיפטה 380 מיקרוליטר של מרק סופר אופטימלי בטמפרטורת החדר עם דיכוי קטבוליט (SOC) לתערובת. מורחים מיד על צלחת אגר LB המכילה אמפיצילין (100 מיקרוגרם/מ"ל) ודוגרים למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס.
   7. בדוק את הצלחות תוך 24 שעות לצמיחה.
   8. אוטמים את הצלחות בניילון איטום ומאחסנים אותן במקרר עד שהן מוכנות לשלב הבא.

4. תגובת שרשרת פולימראז של מושבה (PCR)

1. הוסף לצינור PCR (הגדר 4 צינורות תגובה) את תערובות התגובה המוצגות בטבלה 2.
2. מערבבים בעדינות את התגובות על ידי פיפטינג למעלה ולמטה.
3. בעזרת קצה פיפטה צהוב, מגרדים מושבה (או אזור קטן מאוד) של E. coli שעבר טרנספורמציה. העבירו החלקה של E. coli זה על צלחת LB / אמפיצילין / אגר חדשה שנחתכה, ולאחר מכן הכנס את קצה הפיפטה לצינור ה- PCR. נענע את קצה הפיפטה כדי לערבב את האי קולי עם תערובת ה-PCR. חזור על הפעולה שלוש פעמים נוספות למושבות נוספות. העבירו את צינורות ה-PCR למכונת PCR והתחילו ברכיבה תרמית באמצעות התוכנית המוצגת בטבלה 3.
4. הפעל אלקטרופורזה של ג'ל באמצעות ג'ל אגרוז 2% ב-TAE 9Tris-Acetate-EDTA) כדי לקבוע לאילו מושבות יש את הקשירה הטובה ביותר לפלסמיד, ולגדל את המושבות הללו על צלחת חדשה.
5. אחסן את הצלחות במקרר עד שהן מוכנות לבדיקה. מכינים תרבית נוזלית במרק לוריא עם תוספת של 100 מיקרוגרם/מ"ל אמפיצילין לבדיקה כימית.

5. ריצוף DNA

1. עבור כל דגימה, הוסף 5 מיקרוליטר פלסמיד, 4 מיקרוליטר של פריימר הרצף ו-3 מיקרוליטר של מים נטולי יונים.
2. הכניסו את התערובת הזו לתוך שפופרת ושלחו אותה לריצוף דנ"א (ראו טבלת חומרים).
3. לנתח נתוני רצף DNA כדי להשוות את רצפי ה-DNA הצפויים והנצפים באמצעות תוכנת ניתוח רצפי DNA כדי לוודא שאין מוטציה ושהגנים הוכנסו כהלכה.
   הערה: השימוש ב-E. coli כחיישן כימי מוצג להלן.

6. הכנת תרביות E. coli

1. הכן LB עם 100 מיקרוגרם/מ"ל אמפיצילין לתרביות נוזליות.
2. הכן תרביות נוזליות של חיידקי החיישן, חיידקי הבקרה החיובית* וחיידקי הבקרה השלילית**.
   הערה: *חיידקי בקרה חיוביים: E. coli המכיל פלסמיד עם גן RFP בשליטה של מקדם מכונן; פלסמיד E1010 מרישום החלקים הביולוגיים הסטנדרטיים המשמשים לביולוגיה סינתטית (ראה טבלת חומרים) שימש בעבודה זו.**חיידקי בקרה שליליים: E. coli המכיל פלסמיד עם גן RFP בשליטה של מקדם אחר, כגון מקדם pBad (פלסמיד J10060 מרישום החלקים הביולוגיים הסטנדרטיים המשמשים לביולוגיה סינתטית (ראה טבלת חומרים) או פלסמיד שאין לו את הגן RFP.
3. הכניסו את התרביות לאינקובטור רועד בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-220 סל"ד למשך 8 שעות לפחות, מקסימום 18 שעות. מרק מעונן מעיד על צמיחת חיידקים.

7. טיטרציה של E. coli כדי לבדוק את תפקוד המכשיר

הערה: לאחר שהחיישנים עברו טיטרציה כדי לבדוק את התפקוד, אין צורך לחזור על שלב זה. בקרה חיובית בצורה של תוספת עופרת, אנטימון ו-2,4-DNT או 1,3-דיניטרובנזן (1,3-DNB) יכולה לבדוק את תפקוד המכשירים לכל שימוש ללא צורך בטיטרציה מלאה.

1. הכן תמיסת מלאי של האנליטים המעניינים בריכוז של 10 ppm במים. אם יש בעיה במסיסות, השתמש בתערובת של 50/50 מים/מתנול.
2. השתמש בטבלה 4 כמדריך, סמן את המספר המתאים של צינורות תרבית סטריליים והנח 2 מ"ל מהמרק המתורבת (משלב פרוטוקול 6) בכל שפופרת.
   הערה: על מנת לקבוע טווח אנליטי כללי, בצע לפחות שלוש רמות שונות של אנליט עם חיידקי החיישן, רמה אחת עם הבקרה השלילית ורמה אחת עם הבקרה החיובית. צריך להיות גם צינור אחד של כל אחד מהחיידקים ללא תוספת מתכת (סוג אחר של בקרה שלילית). כדי לקבוע בצורה מדויקת יותר את הטווח האנליטי ואת גבולות הזיהוי, השתמש בטווח גדול יותר של ריכוזי אנליטים.
3. הוסף תמיסת מלאי אנליטים לצינורות המכילים 2 מ"ל מרק כפי שצוין בטבלה 4, הנח את מכסי ההצמדה על צינור התרבות כך שיהיו רופפים (כדי לאפשר זרימת אוויר לתוך הצינור), ומערבל את צינור התרבית.
4. השאירו את מכסי ההצמדה באופן רופף על צינורות התרבית, והניחו אותם באינקובטור רועד ב-220 סל"ד ו-37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות לפחות.
5. הסר את הצינורות מהחממה, הצמד את המכסים על הצינורות בחוזקה ואחסן את הצינורות במקרר עד שהם מוכנים לניתוח פלואורסצנטי.

8. שימוש ב - E. coli כחיישן כימי לשאריות ירי (GSR)

1. בעזרת מגבון על בסיס אתנול המיועד להסרת עופרת (ראה טבלת חומרים), נגב את כל משטחי הידיים, כולל בין האצבעות. השתמש במגבון נפרד לכל יד. אחסן את המגבונים בשקית אטומה עם תווית מתאימה עד לניתוח.
2. למשטחים לבדיקה, השתמש במגבון על בסיס אלכוהול למשטחים גדולים או בצמר גפן רטוב באתנול למשטחים קטנים.
   הערה: כדי להדגים את תגובת החיישנים ל-GSR, החלק הפנימי של מעטפת מחסנית בקליבר 0.40 נשטף עם צמר גפן רטוב באתנול.
3. לבישת כפפות נקיות ושימוש במספריים שנוקו באלכוהול, חותכים^{קטע של} כ-1 ס"מ ממרכז המגבון.
4. הנח את החלק החתוך של מגבון היד או צמר גפן ישירות לתוך צינור תרבית המכיל 2 מ"ל של חיידקי החיישן, וודא שהוא שקוע במרק.
5. המשך כמתואר לעיל בשלבים 7.4 - 7.5.

טבלה 1. תערובת תגובה לקשירה, שלב פרוטוקול 3.1.1.

רכיב	תגובת 20 מיקרוליטר
10X T4 DNA ליגאז מאגר	2 מיקרוליטר
DNA פלסמיד (3 kb)	3 מיקרוליטר
מקדם DNA (0.7kb)	10 מיקרוליטר
מים ללא נוקלאז	4 מיקרוליטר
T4 DNA ליגאז	1 מיקרוליטר

 

 

 

 

 

 

טבלה 2. תערובות תגובה ל-PCR מושבה, פרוטוקול שלב 4.1.

רכיב	תגובת 25 מיקרוליטר
פריימר קדימה μM 10	0.5 מיקרוליטר
פריימר הפוך 10 μM	0.5 מיקרוליטר
OneTaq 2X מאסטר מיקס	12.5 מיקרוליטר
מים ללא נוקלאז	11 מיקרוליטר

 

 

 

 

 

טבלה 3. פרמטרים של מחזור תרמי PCR עבור פרוטוקול שלב 4.3.

צעד	טמפ'	זמן
דנטורציה ראשונית	94 מעלות צלזיוס	30 שניות
30 מחזורים	94 מעלות צלזיוס	30 שניות
	55 מעלות צלזיוס	45 שניות
	68 מעלות צלזיוס	60 שניות
הארכה סופית	68 מעלות צלזיוס	5 דק'
אחז	4 מעלות צלזיוס

 

 

 

 

 

 

 

טבלה 4. ניסוי כללי שנקבע לטיטרציה של חיישנים ביולוגיים, פרוטוקול שלב 7.2.

מזהה צינור	חיידקים	ריכוז תמיסת האנליט שנוספה (ppm)	מתכת הוסיפה	נפח תמיסת האנליט נוסף למרק 2,000 מיקרוליטר	[אנליט], ppb
1	PbRFP	10	Pb	2.5	12
2	PbRFP	10	Pb	75	361
3	PbRFP	10	Pb	150	698
4	PbRFP	0	ללא	0	0
5	RFP neg	10	Pb	10	50
6	הצעות מחיר	10	Pb	10	50

חומרים