בדיקת נחיל להמחשת תנועתיות פני השטח של חיידקים

תקציר

מקור: Morales-Soto, N. et al., הכנה, הדמיה וכימות של מבחני תנועתיות פני השטח של חיידקים. J. Vis. Exp. (2015)

סרטון זה מדגים בדיקת נחיל באמצעות חיידקים המבטאים חלבון פלואורסצנטי ירוק כדי לצפות בתנועתיות פני השטח על אגר רך. הדמיית זמן-lapse לוכדת התרחבות מתואמת והיווצרות קנוקנות, ומדגישה את תנועתיות פני השטח של החיידקים.

פרוטוקול

1. הכנה וחיסון של מדיה לבדיקת נחיל

1. הכנת מדיה
   הערה: הרכב המדיום המתואר להלן ישים למחקרי היווצרות קנוקנות Pseudomonas aeruginosa . אנא עיין במפרטי המדיה בטבלה 1 עבור מבחני תנועתיות פני השטח של Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis ו-Myxococcus xanthus .
   1. מערבבים 200 מ"ל של ביו-כור אירובי נוזלי (FAB)-מינוס אמוניום סולפט ((NH4)₂SO₄) מדיום נחיל (טבלת חומרים), 0.9 גרם אגר אצילי ו-0.2 גרם חומצות קסאמינו (טבלה 1) על ידי ערבוב עם מוט ערבוב מגנטי. השתמש בכמויות קטנות (100-300 מ"ל) כדי לשפר את העקביות בין הניסויים.
   2. חיטוי תערובת אגר/מדיה של 200 מ"ל באמצעות זמן חשיפה של 22 דקות, טמפרטורת חשיפה של 121.1 מעלות צלזיוס ואפשרות אוורור מהירה. הגדרות החיטוי יאפשרו עיקור נכון והמסת אגר, אך ימנעו קרמל אגר.
      הערה: אגר אצילי נוטה לקרמל; תנועתיות החיידקים משתנה על אגר מקורמל.
   3. מיד לאחר סיום מחזור העיקור, סגור את מכסה בקבוק המדיה כדי למנוע אובדן מים על ידי אידוי. עם זאת, שימו לב שמכסה הדוק עלול לגרום לאפקט דמוי "איטום ואקום" על הבקבוק.
   4. מצננים את המדיה ל-50 מעלות צלזיוס תוך ערבוב בטמפרטורת החדר (RT) ומוסיפים 2 מ"ל גלוקוז סטרילי של 1.2 M. לחלופין, הנח את המדיה באינקובטור או באמבט מים של 60 מעלות צלזיוס עד שתהיה מוכנה לשימוש (עד 15 שעות לאחר מכן), והמשך כמצוין. כדי למנוע היווצרות בועות בתקשורת, יש לערבב היטב באמצעות מוט הערבוב המגנטי; בועות על פני האגר ימנעו נחילים אחידים.
      הערה: עבור בדיקות אחרות, הוסף רכיבים רגישים לחום שלא ניתן לבצע חיטוי, כגון חומרים מזינים או צבעים נוספים, בשלב זה, לפי הצורך (למשל, 8 מיקרוליטר צבע Invitrogen Syto 63 לכל 100 מ"ל אגר מומס לתמונה של M. xanthus, כפי שמוצג בתוצאות מייצגות, להלן). תוספת של צבעים מסוימים עשויה להשפיע על התנהגות הנחיל הבסיסית, אותה יש לבדוק מול בקרת צבע שאינה צבע.
   5. במכסה המנוע במעבדה, יש להקצות 7.5 מ"ל של מדיה סטרילית לכל צלחת פטרי פוליסטירן בקוטר 60 מ"מ ולשמור על הצלחות בשכבה אחת (לא מוערמת). למשטח נחיל גדול יותר, יש להקצות 25 מ"ל מדיה לכל צלחת פטרי בקוטר 100 מ"מ. חשוב למלא את הכלים על משטח אופקי אחיד. השתמש בגובה עין שור כדי לבדוק אם המשטח מפולס.
      הערה: עבור מבחני P. aeruginosa, שימוש בנפח מדיה ספציפי לכל צלחת ישפר את העקביות ואת יכולת השחזור. עבור מבחני B. subtilis ו-M. xanthus, יציקה ידנית מניבה תוצאות דומות לנקודות נפח ספציפיות.
2. ריפוי צלחות
   1. עבור צלחות קטנות (60 מ"מ), אפשר למדיום האגר המומס להתרפא (שניהם מוגדרים לנוזל עודף מוצק למחצה ויבש) במכסה המנוע החשוף (כלומר, ללא מכסים) למשך 30 דקות. לוחות גדולים יותר (100 מ"מ) דורשים זמן ריפוי ארוך יותר (ראה דיון).
      הערה: לחלופין, בדיקות מסוימות עשויות לדרוש צלחות להתרפא על הספסל למשך הלילה (20-24 שעות) מכוסות (כלומר, מכסים) בשכבה אחת (טבלה 1). נחיל רגיש הן ללחות עודפת והן ללחות לא מספקת. הלחות, זרימת האוויר והטמפרטורה של כל מעבדה נתונה עשויים לחייב שינוי בריפוי הצלחות כדי לקדם נחיל אופטימלי של החיידק שלך.
   2. חסנו צלחות מיד לאחר סיום תקופת הייבוש. אין לאחסן את הצלחות לשימוש נוסף.
      1. בצע את "בדיקת פיזור הדיו" על ידי איתור לוחית בדיקה עם תערובת של 10 מיקרוליטר של 0.50% (נפח/נפח) דיו הודי שחור עמיד למים של היגינס וחיסון חיידקים. אם תערובת הדיו/חיסון מתפזרת בקלות (כלומר, אינה שומרת על צורת טיפות) על פני המדיה, המדיה תזדקק לזמן נוסף לייבוש.
         הערה: עבור מינים הרגישים במיוחד ללחות (למשל, P. aeruginosa), בצע "בדיקת פיזור דיו" מהירה כדי לקבוע אם הלוחות יבשים מספיק.
3. חיסון בדיקת נחיל
   1. יש לחסן 6 מ"ל של מצע תרבית ציר (ראה טבלה 1 לפרטים) עם מושבה מבודדת מתרבית צלחת מרק ליזוגני טרייה (< 5 ימים אם היא נשארת בטמפרטורת החדר). דגרו על תרביות מרק למשך הלילה (≤18 שעות) בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס או 37 מעלות צלזיוס עם ניעור אופקי (240 סל"ד).
   2. חסנו צלחות נחיל על ידי כתמים עם 1-5 מיקרוליטר של תרבית מרק לילה, או על ידי "תקיעה" של האגר עם קיסם שיניים סטרילי או מחט חיסון תיל.
      הערה: אנו מעדיפים את השיטה האחרונה מכיוון שהיא מפחיתה את הסבירות להתזה של החיסון ומונעת הוספת לחות נוספת לשטח הפנים של הנחיל.
4. דגירה של בדיקת נחיל
   1. לבדיקה כללית, דגרו לוחות בדיקת נחיל ב-30 מעלות צלזיוס או 37 מעלות צלזיוס (או אפילו 42 מעלות צלזיוס עבור B. subtilis; טבלה 1) - זה ספציפי לחיידק. הפוך את הצלחות במהלך הדגירה כך שעודף לחות יתעבה על המכסה, ולא על האגר.
      הערה: טמפרטורה יכולה להשפיע על פנוטיפ וקינטיקה. עבור נחילי P. aeruginosa , דגירה ב-37 מעלות צלזיוס מובילה לצמיחה מהירה יותר ולהתרחבות נחיל מאשר דגירה ב-30 מעלות צלזיוס; עם זאת, המורפולוגיה של נחילים אלה שונה לעתים קרובות עם שינוי הטמפרטורה הזה.
   2. להדמיית זמן-lapse, דגרו על לוחות נחיל בטמפרטורה המתאימה לפני העברתם לתחנת ההדמיה (ראה טבלה 1 לפרטים).
      הערה: הדגירה המוקדמת הזו מאפשרת לנחילים להתחיל את התפתחותם ולהתבסס לפני שהם מועברים לסביבה חדשה, שעשויה להיות אופטימלית או לא לתנועתיות נחילים.

2. הדמיה מקרוסקופית של מבחני תנועתיות פני השטח

1. להדמיית זמן-lapse, לאחר תקופת הדגירה שלפני ההדמיה, הנח את לוחות בדיקת הנחיל על לוחית הדמיה שקופה בתוך תחנת הדמיה מסחרית in vivo . צלם עד שש צלחות בקוטר 60 מ"מ או ארבע לוחות בקוטר 100 מ"מ בכל פעם. מכיוון שהמצלמה מצלמת תמונות מתחת למישור ההדמיה, הפוך את הלוחות כך שהנתיב האופטי לא ייחסם. לחלופין, דגרו בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס או 37 מעלות צלזיוס (טבלה 1) למשך הניסוי, והסירו את הלוחות שיצולמו מהחממה במרווחי זמן מוגדרים.
2. הניחו את המכסים של צלחות הפטרי זקופות על גבי הצלחת המקבילה המחזיקה את המדיה המחוסנת. מלאו את מכסי כלי הפטרי במים כדי למנוע ייבוש יתר במהלך ההדמיה, וסגרו את כל ההתקנה באמצעות מגש שקוף נוסף כדי לשמור על לחות לאורך כל הניסוי.
3. באמצעות תוכנת הדמיה מולקולרית (MI), הפעל בדיקות בטמפרטורת החדר באמצעות הגדרות ההדמיה המתוארות בטבלה 2. להדמיית זמן-lapse, הגדר פרוטוקול עם השלבים והמפרטים הדרושים.

טבלה 1: מפרטים להכנת בדיקת תנועתיות פני השטח. כולל מפרטי הכנת בדיקת תנועתיות פני השטח עבור P. aeruginosa, B. subtilis ו-M. xanthus.

	P. aeruginosa	מחקרי היווצרות קנוקנות P. aeruginosa	ב. סבטיליס	M. xanthus
מדיה של תרבות מרק בן לילה	FAB פלוס 30 מ"מ גלוקוז	FAB פלוס 30 מ"מ גלוקוז	ליברות	CTT (מדיה מורכבת)
טמפרטורת דגירה של תרבית מרק לילה	37 מעלות צלזיוס	37 מעלות צלזיוס	37 מעלות צלזיוס	30 שעות ב-30 מעלות צלזיוס
נחילים של מדיה	מדהים	FAB מינוס (NH4)2SO4	2% (משקל/נפח) LB	CTT
מדיית נחיל: רכיבים נוספים	12 מ"מ גלוקוזa	10% (משקל/נפח) חומצות קסאמינו (CAA), 12 מ"מ גלוקוזa	לא ישים	SYTO® 64א
סוג אגר	אגר, אצילי	אגר, אצילי	אגר מגורען	אגר, אפימטריקס אצילי
ריכוז אגר (wt/vol)	0.45%	0.45%	0.60%	1.50%
גודל צלחת נחיל	60 מ"מ	60 מ"מ	100 מ"מ	150 מ"מ
נפח מדיה לכל צלחת	7.5 מ"ל	7.5 מ"ל	מזיגה ידנית	מזיגה ידנית
הגדרת מדיה/שיטת ייבוש של נחילים	הוד; צלחות חשופות	הוד; צלחות חשופות	צלחות ספסל מכוסות	צלחות ספסל מכוסות
הגדרת מדיה נחילה/זמן ייבוש	30 דקות	30 דקות	לילה (20-24 שעות)	לילה (20-24 שעות)
טמפרטורת הדגירה של בדיקת הנחיל	30 או 37 מעלות צלזיוס	30 מעלות צלזיוס	37 מעלות צלזיוס	30 מעלות צלזיוס
אינקובציה להדמיית דולג זמן	30 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות לפחות	30 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות לפחות	37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים	RT למשך 12 שעות
אורך צילום דולג זמן	24 שעות	24 שעות	10 שעות	66 שעות
הגדרת קיטועי זמן	1 פריים/10 דקות	1 פריים/10 דקות	1 פריים/6 דקות	1 פריים/10 דקות
נוסף לאחר חיטוי.

 

טבלה 2: מפרט הדמיה. מפרט תחנת הדמיה של ברוקר להדמיית פלואורסצנטיות וזוהר אדום וירוק של צמיחת פני השטח של חיידקים.

אות	פלואורסצנטי ירוק	פלואורסצנציה אדומה I	פלואורסצנציה אדומה II	זוהר
חלבון או צבע	חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP)	חלבון mCherry או כתם רמנוליפיד אדום נילוס	סיטו® 64	לוציפראז מהאופרון הלוקס
אורך גל עירור (nm)	480 ± 10	540 ± 10	590 ± 10	כבוי
אורך גל פליטה (ננומטר)	535 ± 17.5	600 ± 17.5	670 ± 17.5	ללא פילטר
זמן חשיפה (שניות)	30	60	60	240
סטופ F	4.0	4.0	2.5	1.1
FOV (מ"מ)	190	190	140	120
מישור מוקד (מ"מ)	27.5	27.5	12.2	4
Binning (פיקסלים)	ללא	2 x 2	ללא	8 על 8

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
ריאגנטסה:
מדיה מינימלית של FAB:				מכינים כל ~ 4 שבועות. למעלה ל -1 ליטר עם ננו-טהור H2O.
(NH4)2סו4	סיגמא	א4418	2 גרם	לא נמצא בשימוש במחקרי היווצרות קנוקנות P. aeruginosa .
2HPO4 x 7H2O	סיגמא-אולדריץ'	S9390	9 גרם
ק"ח2פ"ד4	סיגמא	עמ' 5655	3 גרם
NaCl	ב.ד.ה	BDH8014	3 גרם
תמיסת MgCl2 x 6H2O (198 גרם/ליטר)	פישר סיינטיפיק	M33	1 מ"ל
תמיסת CaCl2 x 2H2O (14 גר'/ליטר)	פישר סיינטיפיק	ג79	1 מ"ל
תמיסת עקבות מתכת (ראה להלן)	לא ישים	לא ישים	1 מ"ל
תמיסת עקבות מתכת:				יש למרוח עד 1 ליטר עם nanopure H2O. יש לשמור בבקבוק זכוכית, תוך ערבוב ולכסות בנייר כסף.
CaSO4 x 2H2O	סיגמא-אולדריץ'	255548	200 מ"ג
MnSO4 x H2O	סיגמא-אולדריץ'	M7634	20 מ"ג
CuSO4 x 5H2O	פישר סיינטיפיק	ג493	20 מ"ג
ZnSO4 x 7H2O	סיגמא-אולדריץ'	Z4750	20 מ"ג
CoSO4 x 7H2O	סיגמא-אולדריץ'	C6768	10 מ"ג
NaMoO4 x 2H2O	סיגמא	S6646	10 מ"ג
ח3בו3	פישר סיינטיפיק	א74	5 מ"ג
FeSO4 x 7H2O	סיגמא-אולדריץ'	F7002	200 מ"ג
מדיית CTT:				הכן לפי הצורך. למעלה ל 100 מ"ל עם nanopure H2O.
Tris-HCl, תמיסת 1 M (התאמה ל-pH 8.0)	אמרסקו	234	1 מ"ל	הכן תמיסת מלאי של 1 M בננו טהור H2O. התאם את ה-pH ל-8.0 ועקר מסנן (נקבוביות 0.2 מיקרומטר).
תמיסת K2HPO4, 1 M (התאמה ל-pH 7.6)	סיגמא-אולדריץ'	עמ' 3786	0.1 מ"ל	הכן תמיסת מלאי של 1 M בננו טהור H2O. התאם את ה-pH ל-7.6 ועקר מסנן (נקבוביות 0.2 מיקרומטר).
תמיסת MgSO4	פישר סיינטיפיק	M65	0.8 מ"ל	הכן תמיסת מלאי של 1 M בננו טהור H2O. עיקור מסנן (נקבוביות 0.2 מיקרומטר).
קזיטון	אבחון BD	225930	1 גרם
ריאגנטים נוספים:
מרק LB, לנוקס	אבחון BD	240230	2 % (משקל/נפח)
D-(+)-גלוקוז	סיגמא-אולדריץ'	G5767	30 מ"מ לתרביות מרק לילה; 12 מ"מ למדיה נחילה	הכן תמיסת מלאי מעוקרת של מסנן 1.2 M בננו טהור H2O. הוסף למדיה לאחר חיטוי.
חומצות קסאמינו (CAA)	אמרסקו	J851	0.10 % (משקל/נפח)	מומלץ למחקרי היווצרות קנוקנות P. aeruginosa . הוסיפו למדיה לפני החיטוי.
אגר, אצילי	סיגמא-אולדריץ'	א5431	0.45 % (משקל/נפח)	אגר אציל מועדף למחקרי תנועתיות פני השטח של P. aeruginosa . הוסיפו למדיה לפני החיטוי.
אגר, אצילי	אפימטריקס	10907	1.50 % (משקל/נפח)	משמש במחקרי תנועתיות פני השטח של M. xanthus . לא מומלץ למחקרי תנועתיות P. aeruginosa . הוסיפו למדיה לפני החיטוי.
אגר, מגורען	פישר סיינטיפיק	BP1423	0.60 % (משקל/נפח)
דיו הודו שחור עמיד למים של היגינס	היגינס	HIG44201	0.50 % (נפח/נפח)	ערבב דיו עם חיסון כדי לבדוק את לחות פני השטח של מדיה נחיל.
SYTO® 64 כתם חומצת גרעין פלואורסצנטית אדומה	Invitrogen	ס-11346		השתמש ב-4 מיקרוליטר (עבור P. aeruginosa) או 8 מיקרוליטר (עבור M. xanthus) של SYTO® 64 לכל 100 מ"ל אגר מותך (נוסף לאחר חיטוי).
חומרים וציוד רלוונטיים:
צלחת פטרי, סטרילית, 150 מ"מ x 15 מ"מ (קוטר x גובה)	VWR	25384-326
צלחת פטרי, סטרילית, 100 מ"מ x 15 מ"מ (קוטר x H)	VWR	25384-342
צלחת פטרי, סטרילית, 60 מ"מ x 15 מ"מ (קוטר x גובה)	VWR	25384-092
In-Vivo Xtream	ברוקר			השתמש להדמיה מקרוסקופית של מחקרי תנועתיות פני השטח. http://www.bruker.com/products/preclinical-imaging/opticalx-ray-imaging/in-vivo-xtreme/overview.html