מיקרוסקופ ניגוד פאזה להערכת מוטציות התפתחותיות בסטרפטומיצס

תקציר

מקור: בנט, ג'יי א. ואח'. הערכה חזותית ומיקרוסקופית של מוטציות התפתחותיות של Streptomyces . J. Vis. Exp. (2018)

סרטון זה מדגים את השימוש במיקרוסקופ ניגודיות פאזה כדי לבחון הבדלים פנוטיפיים בין Streptomyces coelicolor מסוג בר למוטנטי. הוא מתאר את השלבים הכרוכים בהכנה והדמיה של חוטי אוויר לאיתור פגמים התפתחותיים בהיווצרות נבגים.

פרוטוקול

1. בצע מיקרוסקופ ניגודיות פאזה

1. עקר פינצטה על ידי שטיפה ב-70% אתנול ולאחר מכן מעבר דרך להבת מבער בונסן כדי לאדות את האתנול. מניחים להתקרר.
2. עקרו את הכיסויים על ידי שטיפתם ב-70% אתנול ולאחר מכן אפשרו להם להתייבש בצלחת פטרי סטרילית.
3. הכן מעלית כיסוי של גידול החיידקים לבדיקה.
   1. הרם כיסוי סטרילי עם פינצטה סטרילית והנח את הכיסוי על צלחת אגר מקמח סויה מניטול (MS) שבה צמיחת חיידקי Streptomyces coelicolor צפופה. לחץ על גב הכיסויההחלקה בעדינות עם פינצטה כדי להבטיח העברה מספקת של נבגי חיידקים ותפטיר אווירי.
4. הרם את הכיסוי מהצלחת והנח אותו כך שהצד עם חומר התא פונה לכיוון פני השטח של שקופית מיקרוסקופ, עם טיפה של 15 מיקרוליטר של 50% גליצרול שהוכן במים להרכבה. צמצם את בועות האוויר על ידי הצבת החלקת הכיסוי בזווית של 45 מעלות למגלשה ולתת לה ליפול על 50% גליצרול.
5. (אופציונלי) יש לאטום עם לק שקוף לשימור המגלשה.
6. בצע מיקרוסקופ ניגודיות פאזה במרווחי זמן שונים במהלך מחזורי החיים.
   הערה: הדמיה חוזרת מאפשרת ניתוח מלא יותר ויכולת לזהות עיכובים בהתפתחות. חזור באופן עצמאי על התצפיות כדי להבטיח דיוק ושחזור.
   1. הנח את השקופית המוכנה על במת המיקרוסקופ והוסף טיפת שמן טבילה למרכז הכיסוי. סובב את מטרת הפאזה 100X במקומה והגדר את צריח המעבה להגדרת שלב ה"התאמה" המתאימה. מקד את התמונה באמצעות כפתור הכוונון העדין בלבד ברגע שעדשת המטרה נמצאת במגע עם השמן.
   2. בחנו מספר שדות ראייה כדי להבחין בהבדלים בולטים ועקביים בין זנים מוטנטיים לסוג הפראי, כגון היכולת ליצור נבגים, גודל וצורת נבגים ומספר הנבגים הכולל (ראו איור 1).
      הערה: חלופות למיקרוסקופ ניגודיות פאזה כוללות מיקרוסקופ ניגודיות הפרעות דיפרנציאליות (DIC) וטכניקות צביעה פשוטות לשימוש עם מיקרוסקופים בשדה בהיר, כגון צביעת סגול קריסטל.

תוצאות

איור 1: מיקרוגרפים עם ניגודיות פאזה המראים נימה אווירית מייצגת עבור זנים מוטנטיים לבנים של Streptomyces coelicolor המכילים מוטציות אקראיות של החדרת טרנספוזון. (A) מוצג חוט אווירי מייצג ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
50% גליצרול	סיגמא-אולדריץ'	G5516
שמן טבילה (סוג DF)	קרג'יל	16482
מים סטריליים	GeneMate	G-3250-1L
100% אתנול	סיגמא-אולדריץ'	E7023
קמח סויה	הטחנה האדומה של בוב	1516C164
די-מניטול	סיגמא-אולדריץ'	M4125-1 ק"ג
אגר	סיגמא-אולדריץ'	A1296-1 ק"ג
גליצרול 100%	VWR אמרסקו מדעי החיים	0854-1L
צלחות פטרי	סיגמא-אולדריץ'	P5856-500EA
תעודות כיסוי #1.5	תומאס סיינטיפיק	64-0721
שקופיות	קרוליינה	63-2010
מיקרוסקופ ניגודיות פאזה	אולימפוס	BX40
מלקחיים	קרולינה ביולוגית	624504
מבער בונסן	קרולינה ביולוגית	706706
לק שקוף	OPI	22001009000
מצלמה למיקרוסקופ	אולימפוס	DP72
כפפות לבדיקת ניטריל (Med)	ביו אקסל	71011002