תת-תרבית של חיידקים אנאירוביים מפחיתי סולפיט מתרבית אגר

תקציר

מקור: Anwar, Z., et al. העשרה וזיהוי של רעלנים של קלוסטרידיום פרפרינגנס בדגימות מזון קמעונאיות. J. Vis. Exp. (2019).

בסרטון זה, חיידקים מפחיתי סולפיט מתורבתים במדיום אגר המכיל סולפיט, שם הם גדלים בצורה אנאירובית ומפחיתים סולפיט למימן גופרתי, ויוצרים משקעים שחורים עם יוני ברזל. מושבות שחורות מבודדות מעומק האגר בטכניקות אספטיות ומועברות למדיום טרי להמשך דגירה אנאירובית.

פרוטוקול

הערה: קלוסטרידיום פרפרינגנס נחשב לאורגניזם סכנה ביולוגית ברמה 2 (BSL2). למרות שלא כל דגימות המזון יכילו C. perfringens, יש להתייחס לכל הדגימות המתורבתות ככאלה. יש ללבוש את כל אמצעי הזהירות המתאימים וציוד מגן לכוח אדם (PPE) בכל עת. לטהר את כל החומר לפני השלכתו.

1. הכן סל"ד שונה (מדיום פרפרינגנס מהיר)

1. יש לשלב 30 גרם/ליטר תיוגליקולט מדיום נוזלי, 60 גרם/ליטר ג'לטין, 5 גרם/ליטר פפטון, 5 גרם/ליטר גלוקוז, 5 גרם/ליטר אשלגן פוספט דו-בסיסי, 3 גרם/ליטר תמצית שמרים, 1.5 גרם/ליטר נתרן כלורי, 0.5 גרם/ליטר ברזל גופרתי במים נטולי יונים עד לפיזור אחיד. בדרך כלל אנו מייצרים קבוצות של 1 ליטר.
2. חיטוי ב-121 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
3. מניחים להתקרר לכ-40 מעלות צלזיוס.
4. לאחר שהסל"ד מתקרר, הוסיפו D-ציקלוסרין לריכוז סופי של 440 מ"ג/ליטר.
   הערה: ריכוזי מלאי של D-cycloserine מומס במים סטריליים ב-50 מ"ג/מ"ל עשויים להיות מאוחסנים ב-20 מעלות צלזיוס לשימוש עתידי.
5. העבירו אספטית 10 מ"ל סל"ד לצינורות חרוטיים של 15 מ"ל. ניתן להכין סל"ד בקבוצות ולאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד חודש.
6. יש לחמם את הסל"ד ל-37 מעלות צלזיוס לפני השימוש.

2. איסוף דגימות ודגירה של סל"ד

1. הובלת מזון למעבדה בטמפרטורות הסביבה תוך שעה. ניתן להעביר מזון באריזה מקורית או במיכלים סטריליים. אם לא נבדק מיד, ניתן לאחסן מזון בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס עד לשימוש. אם יש, יש לציין את סוג המזון וארץ המוצא על פי תווית האריזה, כמו גם כל מידע רלוונטי אחר.
2. מוציאים כ-1.0-2.0 גרם מזון ומעבירים לצלחת פטרי סטרילית או שווה ערך. טוחנים דק בעזרת סכין גילוח או אזמל סטרילי.
3. יש לחסן לתוך 10 מ"ל של מי מלח עם חוצץ פוספט (PBS) בצינור חרוטי של 15 מ"ל. מערבבים היטב.
   1. כדי לבחור תאים צמחיים, העבירו 5 מ"ל מתערובת PBS-מזון לצינור חרוטי של 15 מ"ל המכיל 10 מ"ל סל"ד. אבטח את המכסה בחוזקה.
   2. כדי לבחור נבגים, מחממים את 5 המ"ל הנותרים של תערובת מזון PBS בטמפרטורה של 85 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות ולאחר מכן מעבירים לצינור חרוטי של 15 מ"ל המכיל 10 מ"ל סל"ד. אבטח את המכסה בחוזקה.
4. מערבל והפוך את תרביות המזון בסל"ד כדי להבטיח ערבוב מלא.
5. אטמו היטב את הצינורות החרוטיים ועטפו את המכסים בניילון פרפין או בניילון נצמד כדי להבטיח סביבה אנאירובית.
6. יש לדגור למשך הלילה (ON) בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
7. למחרת בבוקר, שימו לב לכל עכירות או תסיסה בצינורות סל"ד.

3. ציפוי "כריך" TSC (טריפטוז סולפיט ציקלוסרין)

1. חיסון תרביות ON RPM לאגר TSC באמצעות טכניקת "סנדוויץ'" (איור 1) המתוארת להלן.
2. הכן אגר TSC לפי הוראות היצרן.
   1. הכינו את שכבת הבסיס של צלחות ה-TSC על ידי העברת 10 מ"ל אגר TSC מותך לצלחות פטרי סטריליות והניחו להתמצקות. ניתן להכין אותם מראש ולאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. יש לוודא שהצלחות מחוממות לטמפרטורת החדר לפני השימוש.
   2. עבור השכבה העליונה של צלחת ה-TSC, שמור על אגר ה-TSC המותך שנותר ב-40 מעלות צלזיוס.
      הערה: למרות שנקודת ההיתוך של אגר היא מעל 85 מעלות צלזיוס, אגר מותך מתמצק בסביבות 32-45 מעלות צלזיוס.
3. אחזר בזהירות את תרביות הסל"ד והעביר 100 מיקרוליטר לבסיס אגר TSC. בגלל התסיסה, תרבויות מסוימות עשויות להיות בלחץ. הקפד ללבוש את כל ה- PPE המתאים.
4. מורחים את חיסון הסל"ד באמצעות חרוזי זכוכית מעוקרים או מפזר תאים.
5. אפשר לסל"ד "להיספג" באגר TSC למשך 5-10 דקות בטמפרטורת החדר.
6. העבירו בזהירות 20 מ"ל של אגר TSC מותך, 40 מעלות צלזיוס לצלחת באמצעות פיפטה סרולוגית.
7. החזר את מכסה צלחת הפטרי למקומו ואפשר לאגר TSC להתמצק לחלוטין בטמפרטורת החדר.
8. הופכים את צלחת הפטרי ודוגרים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
9. אם רוצים דילולים סדרתיים, בצע דילולים של תרביות ON RPM לסל"ד טרי ומחומם מראש לפני החיסון לאגר TSC.

4. תת-תרבות של מושבות מפחיתות סולפיט

1. למחרת בבוקר, הוציאו את הצלחות מהחממה ובדקו אם יש צמיחת חיידקים. חיידקים אירוביים עשויים להימצא על פני האגר. יימצאו חיידקים אנאירוביים הגדלים בתוך האגר. חיידקים מפחיתי סולפיט יהפכו את האגר שמסביב לשחור. מושבות אפשריות של C. perfringens יהיו שחורות ומשובצות באגר.
2. מושבות חשודות של C. perfringens יהיו חיוביות להפחתת סולפיט וייראו שחורות, משובצות בתוך האגר. בעזרת טפטפת סטרילית לשימוש חד פעמי, "מורטים" את המושבות השחורות מהאגר ומעבירים ל-10 מ"ל סל"ד טרי בצינור חרוטי של 15 מ"ל. חשוב להוציא את האוויר מהטפטפת לפני ניקוב אגר.
3. אם יש כמות צפופה של גידול חיידקים אירובי על פני הצלחת, השתמש במגרד תאים סטרילי כדי להסיר מושבות מאזורים נבחרים. ניתן לדגום מספר מושבות החשודות כ-C. perfringens, מאותה לוחית TSC לתרביות סל"ד נפרדות.
4. מהדקים היטב את מכסי הצינור החרוטי ועוטפים בניילון פרפין או בניילון. יש לדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.

תוצאות

איור 1: סכמטי של טכניקת כריך אגר TSC.

חומרי סל"ד המכילים את חיידקי C. perfringens מצופים בין שתי שכבות של אגר TSC על מנת לקדם סביבה אנאירובית.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
די-ציקלוסרין	סיגמא-אולדריץ'	C6880
דקסטרוז	סיגמא מדעי החיים	D9434-250G
צנרת העברה חד פעמית	כל מותג		בחר אחד עם קצה דק כמו צנרת העברה חד פעמית Thermo Scientific 137116M/EMD
ערכות דם ורקמות DNeasy	קיגן	69504	הערה: ערכות מיצוי DNA ופלסמיד רבות הוערכו, ערכה זו נתנה את התוצאות הרצויות ביותר.
אינקובטור יבש	כל מותג
מדיום תיוגליקולט נוזלי	רמל	R453452
ג'לטין מעור חזיר	סיגמא מדעי החיים	G1890-500 גרם
ברזל (II) סולפט הפטהידראט	סיגמא מדעי החיים	F8633-250 גרם
ליזוזים מחלבון ביצת עוף	סיגמא-אולדריץ'	L6876	דרוש למיצוי DNA, לא מסופק בערכה
פרפילם או ניילון נצמד	כל מותג
פפטון מקזאין וחלבונים אחרים מן החי	סיגמא-אולדריץ'	70173-100 גרם
בסיס אגר Perfringens (TSC + SFP)	אוקסואיד	CM0587	הכינו אגר TSC לפי ההוראות
אשלגן פוספט דו-בסיסי	סיגמא-אולדריץ'	P2222-100 גרם
נתרן כלורי	סיגמא-אולדריץ'	ס-7653
מגרד תאים סטרילי	כל מותג
מפזר תאים סטרילי	כל מותג
צלחות פטרי סטריליות	כל מותג
תמצית שמרים	סיגמא-אולדריץ'	70161-100 גרם