Thin-Layer Chromatography-Based Separation of (p)ppGpp Nucleotides Isolated from Stress-Induced Bacteria

doi:10.3791/24064

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Research Article

הפרדה מבוססת כרומטוגרפיה בשכבה דקה של נוקלאוטידים (p)ppGpp מבודדים מחיידקים המושרים על ידי מתח

September 16, 2025

Cite Watch Download PDF Download Material list

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

In This Article

Abstract Protocol Representative Results Materials Reprints and Permissions

Abstract

מקור: Fernández-Coll, L. and Cashel, M. שימוש בתיוג רדיו של צלחת מיקרוטיטר למדידות מרובות in vivo של Escherichia coli (p)ppGpp ואחריו כרומטוגרפיה של שכבה דקה. J. Vis. Exp. (2019)

סרטון זה מציג פרוטוקול תפוקה גבוהה למדידת הרמות והדינמיקה של נוקלאוטידים של תגובת עקה חיידקית ppGpp ו-pppGpp באמצעות כרומטוגרפיה של שכבה דקה (TLC). השיטה מספקת גישה עוצמתית, מהירה וחסכונית לכימות (p)ppGpp בתרביות חיידקים בתנאי עקה שונים, ומאפשרת ניתוח ברזולוציה גבוהה של הפיזיולוגיה של החיידקים והתגובה המחמירה.

Protocol

כרומטוגרפיה בשכבה דקה
1. בעזרת עיפרון רך, סמן קו מקור 1 ס"מ מקצה צלחת כרומטוגרפיה בשכבה דקה (TLC) בגודל 20 ס"מ על 20 ס"מ (PEI-תאית) שהוסרה 5 ס"מ מלמעלה בעזרת מספריים. מרחו 5 מיקרוליטר כטיפה על משטח PEI עבור כל דגימה. התחל בפיתוח עולה מבלי לאפשר לנקודה זו להתייבש, מה שמשפר את הרזולוציה על ידי מזעור הפסים.
2. בצע התפתחות עולה במיכל עם שכבה של תמיסה של 1.5 M KH₂PO₄ (pH 3.4) רדודה מספיק כדי שהנוזל לא ייגע בנקודת דגימת המקור. מכסים את המיכל בחותם אטום לאוויר ומאפשרים עלייה נוזלית לראש הסדין הגזום, 15 ס"מ. כדי להשיג pH 3.4 עבור תמיסה של 1.5 M KH₂PO₄ , יש צורך להתאים את ה-pH על ידי הוספת H₃PO₄.
3. הסר את הכרומטוגרמה המפותחת במלואה וייבש באוויר בטמפרטורת החדר.
4. חותכים וזורקים את החלק העליון (ה-pH הקדמי) של הכרומטוגרמה המכיל את ^ה-32P החופשי לפסולת רדיואקטיבית. חלק זה מיוצג בצבע צהוב באיור 1 וניתן להמחשה בקלות תחת אור UV. אם מודדים רק נוקלאוטידים (p)ppGpp הנודדים לאט יותר מגואנוסין טריפוספט (GTP), מומלץ להריץ תקן GTP גלוי UV ולאחר מכן לחתוך ולזרוק חלק עליון גדול יותר (כל דבר מעל GTP, כפי שמוצג באיור 1).
5. חשוף סרטים אוטורדיוגרפיים בן לילה עם מסך זרחן.
6. פתח את הסרט. לכוד וכמת את אות מסך הזרחן באמצעות פוספו-דימויימר.
כימות של (p)ppGpp
1. כמת כתמים רדיואקטיביים עם תמונה J.
  הערה: ניתן לנרמל את כמות (p)ppGpp לכמות הכוללת של נוקלאוטידים G שנצפתה בכל דגימה (איור 1). אם כמות הרקע הומוגנית, ניתן להחסיר ריק בודד (תיבה 4 מאיור 1) כדי לתקן את הרקע. סה"כ G הוא הסכום של GTP + ppGpp + pppGpp שזוהה. נורמליזציה זו מניחה שרמות גואנוזין מונופוספט (GMP) וגואנוסין דיפוספט (תמ"ג) הן זניחות, וזה נכון לגבי Escherichia coli. היחס בין נוקלאוטיד נתון לסך G מספק דרך חשובה לתקן שינויים בנפח הדגימה המיושם.

Representative Results

איור 1: ניתוח TLC מייצג. ייצוג סכמטי של התוצאות שהתקבלו לאחר אוטוררדיוגרפיה ובדיקת זרחן במהלך הלילה עם TLC. הכתמים שיש למדוד מוצגים באדום. הנוסחה לחישוב הכמות החלקית של ppGpp מוצגת גם היא. סה"כ G מתייחס לכמות הכוללת של GTP + ppGpp + pppGpp שזוהתה בדגימה. הפס הצהוב מייצג את חזית ה-pH הנראית תחת אור UV. מספריים מציינים היכן אנו ממליצים לחתוך את הכרומטוגרמה להשלכת מרבית הרדיואקטיביות. החץ מציין את כיוון הזרימה במהלך התפתחות עולה עם מאגר פוספט 1.5 M

Materials

סרט אוטורדיוגרפיה	דנוויל סיינטיפיק בע"מ	E3218
מסך זרחן אחסון	קודאק	אז 230
TLC PEI תאית F	מרק-מיליפור	1.05579.0001
מצלמת טייפון 9400	GE Healthcare
KH₂PO₄	פישר ביוטק	BP362-500
H₃PO₄	ג'יי טי בייקר	0260-02

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request Permission

Play Video