הפרדה מבוססת כרומטוגרפיה בשכבה דקה של נוקלאוטידים (p)ppGpp מבודדים מחיידקים המושרים על ידי מתח

Abstract

מקור: Fernández-Coll, L. and Cashel, M. שימוש בתיוג רדיו של צלחת מיקרוטיטר למדידות מרובות in vivo של Escherichia coli (p)ppGpp ואחריו כרומטוגרפיה של שכבה דקה. J. Vis. Exp. (2019)

סרטון זה מציג פרוטוקול תפוקה גבוהה למדידת הרמות והדינמיקה של נוקלאוטידים של תגובת עקה חיידקית ppGpp ו-pppGpp באמצעות כרומטוגרפיה של שכבה דקה (TLC). השיטה מספקת גישה עוצמתית, מהירה וחסכונית לכימות (p)ppGpp בתרביות חיידקים בתנאי עקה שונים, ומאפשרת ניתוח ברזולוציה גבוהה של הפיזיולוגיה של החיידקים והתגובה המחמירה.

Protocol

1. כרומטוגרפיה בשכבה דקה
   1. בעזרת עיפרון רך, סמן קו מקור 1 ס"מ מקצה צלחת כרומטוגרפיה בשכבה דקה (TLC) בגודל 20 ס"מ על 20 ס"מ (PEI-תאית) שהוסרה 5 ס"מ מלמעלה בעזרת מספריים. מרחו 5 מיקרוליטר כטיפה על משטח PEI עבור כל דגימה. התחל בפיתוח עולה מבלי לאפשר לנקודה זו להתייבש, מה שמשפר את הרזולוציה על ידי מזעור הפסים.
   2. בצע התפתחות עולה במיכל עם שכבה של תמיסה של 1.5 M KH₂PO₄ (pH 3.4) רדודה מספיק כדי שהנוזל לא ייגע בנקודת דגימת המקור. מכסים את המיכל בחותם אטום לאוויר ומאפשרים עלייה נוזלית לראש הסדין הגזום, 15 ס"מ. כדי להשיג pH 3.4 עבור תמיסה של 1.5 M KH₂PO₄ , יש צורך להתאים את ה-pH על ידי הוספת H₃PO₄.
   3. הסר את הכרומטוגרמה המפותחת במלואה וייבש באוויר בטמפרטורת החדר.
   4. חותכים וזורקים את החלק העליון (ה-pH הקדמי) של הכרומטוגרמה המכיל את ^ה-32P החופשי לפסולת רדיואקטיבית. חלק זה מיוצג בצבע צהוב באיור 1 וניתן להמחשה בקלות תחת אור UV. אם מודדים רק נוקלאוטידים (p)ppGpp הנודדים לאט יותר מגואנוסין טריפוספט (GTP), מומלץ להריץ תקן GTP גלוי UV ולאחר מכן לחתוך ולזרוק חלק עליון גדול יותר (כל דבר מעל GTP, כפי שמוצג באיור 1).
   5. חשוף סרטים אוטורדיוגרפיים בן לילה עם מסך זרחן.
   6. פתח את הסרט. לכוד וכמת את אות מסך הזרחן באמצעות פוספו-דימויימר.
       
2. כימות של (p)ppGpp
   1. כמת כתמים רדיואקטיביים עם תמונה J.
      הערה: ניתן לנרמל את כמות (p)ppGpp לכמות הכוללת של נוקלאוטידים G שנצפתה בכל דגימה (איור 1). אם כמות הרקע הומוגנית, ניתן להחסיר ריק בודד (תיבה 4 מאיור 1) כדי לתקן את הרקע. סה"כ G הוא הסכום של GTP + ppGpp + pppGpp שזוהה. נורמליזציה זו מניחה שרמות גואנוזין מונופוספט (GMP) וגואנוסין דיפוספט (תמ"ג) הן זניחות, וזה נכון לגבי Escherichia coli. היחס בין נוקלאוטיד נתון לסך G מספק דרך חשובה לתקן שינויים בנפח הדגימה המיושם.

Results

איור 1: ניתוח TLC מייצג. ייצוג סכמטי של התוצאות שהתקבלו לאחר אוטוררדיוגרפיה ובדיקת זרחן במהלך הלילה עם TLC. הכתמים שיש למדוד מוצגים באדום. הנוסחה לחישוב הכמות החלקית של ppGpp מוצגת גם היא. סה"כ G מתייחס לכמות הכוללת של GTP + ppGpp +...

Materials