תרבית תא בודד של חיידקים בתוך שלפוחיות ענק

תקציר

מקור: Morita, M., et al. תרבית תאי חיידקים ברמת התא הבודד בתוך שלפוחיות ענק. J. Vis. Exp. (2019).

סרטון זה מדגים שיטה לתרבית והתבוננות בתאי חיידקים בודדים עטופים בתוך שלפוחיות ענק המעוגנות לשכבת שומנים דו-שכבתית. המערכת מאפשרת הדמיה יציבה וארוכת טווח של דינמיקת גדילה של תא בודד במיקרו-סביבה מוגבלת ורלוונטית מבחינה פיזיולוגית.

פרוטוקול

1. הכנת מערכת תצפית שלפוחית ענקית (GV) (מערכת תרבית תאים חיידקית)

1. הכנת שלפוחיות קטנות (SVs) לבניית ממברנה דו-שכבתית נתמכת
   1. יוצקים 20 מיקרוליטר מתמיסת POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) ו-4 μL של תמיסת ביוטין-PEG-DSPE (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[biotinyl(polyethyleneglycol)-2000) לתוך צינור זכוכית.
   2. אידוי הממס האורגני על ידי זרימת אוויר ליצירת סרט שומני והנח דגימה זו בחומר ייבוש למשך שעה אחת כדי לאדות לחלוטין את הממס האורגני.
   3. הוסף 200 מיקרוליטר של 200 מ"מ גלוקוז במדיום 1x LB (מרק לוריא-ברטני) (התמיסה המימית החיצונית של GVs) לבקבוקון הזכוכית.
   4. עטפו את החלק הפותח של בקבוקון הזכוכית בסרט והפכו אותו לסוניקציה באמבט קולי (120 וואט) למשך שעה לפחות.
   5. הכן SVs בשיטת האקסטרוזיה באמצעות מיני מכבש וממברנת פוליקרבונט בגודל נקבוביות של 100 ננומטר.
2. הכנת תא בעבודת יד
   1. קדחו חור בגודל 7 מ"מ עם אגרוף חלול על אטם דו פרצופי (10 מ"מ x 10 מ"מ x 1 מ"מ).
   2. הדבק את החותם הדו-פרצופי עם החור על זכוכית כיסוי (30 מ"מ על 40 מ"מ, עובי 0.25-0.35 מ"מ).
3. הכנת קרום דו-שכבתי נתמך על זכוכית הכיסוי בחור החדר
   1. הוסף 30 מיקרוליטר מתמיסת SV לחור החדר (שהוכן בסעיף 2.2) ודגר ב-RT למשך 30 דקות.
   2. שטפו בעדינות את החור פעמיים עם 20 מיקרוליטר של מדיום 1x LB המכיל 200 מ"מ גלוקוז (התמיסה המימית החיצונית של GVs) על ידי פיפטינג.
4. קיבוע של GVs על הממברנה הדו-שכבתית הנתמכת על זכוכית הכיסוי בחור החדר
   1. הכניסו 10 מיקרוליטר של נויטרווידין עם התמיסה המימית החיצונית של GVs (1 מ"ג/מ"ל) לתוך החור ודגרו ב-RT למשך 15 דקות.
   2. שטפו בעדינות את החור פעמיים עם 20 מיקרוליטר של מדיום 1x LB המכיל 200 מ"מ גלוקוז (התמיסה המימית החיצונית של GVs) על ידי פיפטינג.
   3. הוסף את כל התמיסה המכילה GV לתוך חור התא ואטום עם זכוכית כיסוי (18 מ"מ x 18 מ"מ, עובי 0.13-0.17 מ"מ) (איור 1b).
5. תצפית מיקרוסקופית על גדילת תאי חיידקים בתוך GVs
   1. הגדר מערכת שלב חימום מיקרוסקופית עם מיקרוסקופ הפוך המצויד בעדשת אובייקט עם צמצם מספרי (NA) של 40x/0.6 עם מרחק עבודה ארוך (איור 1b).
   2. הנח את החדר על מערכת החימום המיקרוסקופית (איור 1 ב). דגרו על ה-GVs המכילים תאי חיידקים בתא בתנאים סטטיים למשך 6 שעות ב-37 מעלות צלזיוס.
   3. צלם והקלט תמונות מיקרוסקופ של צמיחת תאי חיידקים בתוך GV כל 30 דקות באמצעות מצלמת מוליכים למחצה תחמוצת מתכת משלימה (sCMOS) מדעית.

תוצאות

איור 1: מערכת התצפית של תרבית תאי חיידקים בתוך GVs. (א) GVs משותקים על קרום נתמך באמצעות קשירת ביוטין-נויטרווידין על זכוכית הכיסוי. GV מודגרים על ידי מערכת חימום. (ב) תמונה של מערכת התצפית, כולל תא עבודת יד.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
בקטוטריפטון	BD Biosciences	211705
כלורופורם	Wako כימיקלים טהורים	032-21921
זכוכית כיסוי (18 × 18 מ"מ)	Matsunami Glass Ind.	C018181	עובי 0.13–0.17 מ"מ
זכוכית כיסוי (30 × 40 מ"מ)	Matsunami Glass Ind.	הזמנה מותאמת אישית	עובי 0.25–0.35 מ"מ
צנטריפוגה שולחנית	חברת היי-טק	ATT101	סוג רוטור נדנדה
אטם דו-צדדי (10 × 10 × 1 מ"מ)	ניטומס	T4613
גלוקוז	Wako כימיקלים טהורים	049-31165
מיקרוסקופ הפוך	אולימפוס	IX-73
מתנול	Wako כימיקלים טהורים	133-16771
מערכת חימום מיקרוסקופית stage	להיט טוקאי	TP-110R-100
שמן מינרלי	נקלאי טסקה	23334-85
נויטראוודין	תרמו פישר סיינטיפיק	31000
עדשת אובייקט	אולימפוס	לוקפלן 40×/0.6 נא
ממברנות פוליקרבונט	ליפידים קוטביים של Avanti	610005
מצלמת sCMOS	אנדור	זילה 4.2 פלוס	גודל נקבוביות 100 ננומטר
נתרן כלורי	Wako כימיקלים טהורים	191-01665
סוכרוז	Wako כימיקלים טהורים	196-00015
אמבט אולטרסאונד	כאחד	ASU-3D
תמצית שמרים	BD Biosciences	212750
צינור פלסטיק מכוסה 0.6 מ"ל	ווטסון	130-806 צלזיוס
צינור פלסטיק מכוסה 1.5 מ"ל	סומיטומו בקליט ושות'	MS4265-M
1-פלמיטויל-2-אולויל-SN-גליצרו-3-פוספוקולין	ליפידים קוטביים של Avanti	850457פ
1,2-דיסטארויל-סנגליצרו-3-פוספואתנולמין-N-[ביוטיניל (פוליאתילן גליקול)-2000]	ליפידים קוטביים של Avanti	880129פ	POPC
			ביוטין-PEG-DSPE