חקירת תגובת החיידקים לאתילן באמצעות תרכובת משחררת אתילן

תקציר

מקור: Augimeri, R. V. et al., תוך שימוש בתרכובת משחררת האתילן, חומצה 2-כלורו-אתילפוספונית, ככלי לחקר תגובת אתילן בחיידקים. J. Vis. Exp. (2016)

סרטון זה מדגים את ההשפעה של אתילן שנוצר על ידי חומצה 2-כלורו-אתילפוספונית (CEPA) על צמיחת חיידקים וייצור תאית. אתילן מפעיל מסלולי איתות הממריצים סינתזת תאית, וכתוצאה מכך היווצרות פליקל משופרת. תוצאות אלה מדגישות את התגובה החיידקית לאתילן.

פרוטוקול

1. מבחני פליקל
   1. לגדל ולכמת תרביות התחלה של Komagataeibacter xylinus בשלוש עותקים:
      1. בשלוש עותקים, יש לחסן מושבה אחת של Komagataeibacter xylinus לתוך 5 מ"ל של מדיום Schramm and Hestrin (SH) (pH 5) בתוספת 0.2% (v/v) צלולאז מעוקר בפילטר. דגירה של תרביות ב-30 מעלות צלזיוס עם תסיסה ב-150 סל"ד עד שמגיעים לצפיפות אופטית ב-600 ננומטר (OD₆₀₀) של 0.3 עד 0.4 (כ-72 שעות).
      2. קציר תרביות התחלה על ידי צנטריפוגה (2,000 x גרם; 4 מעלות צלזיוס; 10 דקות). שטפו את התאים פעמיים עם 5 מ"ל מי מלח סטריליים והשעו מחדש את גלולת התאים. שמור את התאים על קרח.
      3. כימות תאים באמצעות תא ספירה של פטרוף-האוסר.
   2. הכן תערובות מאסטר לחיסון צלחות 24 בארות:
      1. תוסף 60 מ"ל של מדיום SH (pH 7) עם 120 מיקרוליטר ממלאי 5, 50 ו-500 מ"מ של חומצה 2-כלורו-אתילפוספונית (CEPA) כדי לקבל ריכוזי CEPA סופיים של 0.01, 0.1 ו-1.0 מ"מ, בהתאמה. הוסיפו עוד 60 מ"ל של מדיום SH (pH 7) עם 120 מיקרוליטר של הממס המשמש להמסת CEPA. מערבולת לערבב.
      2. חלקו כל 60 מ"ל של מדיום המכיל CEPA לארבע מנות של 14 מ"ל. יש לחסן שלושה מתוך 14 מ"ל אליקוטים עם שכפולים ביולוגיים של תרבית המתנע בריכוז של 10⁵ תאים/מ"ל. שמור צינורות עם תאים על קרח כדי למנוע ייצור תאית.
         הערה: 14 מ"ל הנותרים ישמשו לבארות בקרה סטריליות.
   3. חיסון צלחות 24 בארות:
      1. בדוק כל טיפול בצלחת משלו עם שלוש שורות של שכפולים ביולוגיים ושורה של בקרות סטריליות (איור 1).
      2. בעזרת תערובת המאסטר של 14 מ"ל, מוסיפים 2 מ"ל לכל אחת משש הבארות של צלחת סטרילית של 24 בארות. הושלם עבור שלושת השכפולים הביולוגיים והבקרה הסטרילית (איור 1). חזור על כל טיפול.
      3. אוטמים צלחות עם סרט פרפין ודוגרים באופן סטטי למשך 7 ימים בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס.
      4. קציר ומדידת משקל יבש של הפליקל (תפוקת תאית) (איור 1):
         1. העבירו בנפרד את הפליקלים לבארות של צלחת 6 בארות. כדי ליז תאים, טפל בפליקלים עם 12 מ"ל של 0.1 N נתרן הידרוקסיד (NaOH) בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
         2. הסר את ה-NaOH ונטרל את הפליקלים על ידי שטיפה במים טהורים במיוחד למשך 24 שעות עם תסיסה. החלף מים כל 6 שעות.
            הערה: הפליקלים צריכים להיות לבנים עם סיום שלב הכביסה.
         3. הניחו משקולות פליקל על מחצלות סיליקון וייבשו בטמפרטורה של 50 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות למשקל קבוע. לאחר הייבוש, הסר אותם מהמחצלות ומדוד את משקלם בקנה מידה אנליטי כדי לקבוע את תפוקת התאית החיידקית.

תוצאות

איור 1: תרשים זרימה הממחיש את הפרוטוקול המשמש לבדיקה וניתוח פליקל. מדיום pH 7 SH בתוספת CEPA (60 מ"ל) מיועד לשלושה חיסונים ביולוגיים נפרדים ובקרה סטרילית (14 מ"ל כל אחד). תרביות אלה מוכנסות לאחר מכן לשישה שכפולים טכניים (2 מ"ל) לצלחת של 24 בארות ולאחר מכן נאטמות בסרט פרפי...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
צלולאז מ - Trichoderma reesei ATCC 26921	סיגמא	C2730	תמיסה מימית
חומצת לימון	ביושופ	CIT002.500	עבור SH בינוני
אתפון (≥ 96%; חומצה 2-כלורו-אתילפוספונית)	סיגמא	ג0143	תרכובת משחררת אתילן
גלוקוז	ביובייסיק	GB0219	עבור SH בינוני
Komagataeibacter xylinus ATCC 53582	ATCC	53582	אלפפרוטאובקטריום המייצר תאית חיידקית
נתרן פוספט, הפטהידראט דו-בסיסי	ביושופ	SPD579.500	נתרן פוספט, הפטאהידרט דו-בסיסי למדיום SH
NaCl	ביובייסיק	SOD001.1	נתרן כלורי לתמיסת מלח ובקרה
נתרן פוספט, מונוהידראט מונו-בסיסי	ביושופ	SPM306.500	נתרן פוספט, מונוהידראט מונו-בסיסי לתמיסת בקרה
נאוה	ביושופ	שי700.500	נתרן הידרוקסיד להתאמת pH
סרט פרפין	פרפילם	PM996	לאיטום צלחות וצלוחיות
פפטון (בקטריולוגי)	ביושופ	PEP403.1	עבור SH בינוני
חדר הספירה של פטרוף-האוסר	האוסר סיינטיפיק	3900	תא ספירת תאי חיידקים
מסנן עיקור פוליאתרסולפון 0.2 מיקרומטר	VWR	28145-501	לעיקור צלולאז
תמצית שמרים	ביובייסיק	G0961	עבור SH בינוני