הגברה של פלסמיד מתאבד במארח חיידקים

תקציר

מקור: Tomás, J. M., et al. יצירת מוטציות אפס כדי להבהיר את תפקידם של גליקוזילטרנספראזות חיידקיות בתנועתיות חיידקים. J. Vis. Exp. (2022).

סרטון זה מדגים את ההגברה התלויה ביוזם של פלסמיד מתאבד ב - E. coli. הפלסמיד, הנושא גן עמידות לאנטיביוטיקה, משתכפל רק בנוכחות חלבון יוזם המקודד על ידי המארח. לאחר אלקטרופורציה ודגירה במדיום התאוששות, התערובת מצופה על אגר המכיל אנטיביוטיקה. חיידקים עם פלסמיד שורדים, מכיוון שהחלבון היוזם שלו מאפשר ביטוי של הגן העמיד לאנטיביוטיקה של הפלסמיד.

פרוטוקול

1. יצירת מוטציות אפס בגנים של אי הגליקוזילציה של הדגל

הערה: שיטה זו של מוטגנזה מבוססת על החלפה אללית של תוצרי מחיקה בתוך מסגרת של תגובת שרשרת פולימראז (PCR) באמצעות וקטור ההתאבדות pDM428 (GenBank: KC795686.1). שכפול של וקטור pDM4 תלוי בלמבדה פיר , והחילוף האללי המלא נכפה על ידי שימוש בגן sacB הממוקם על הווקטור.

1. בניית מוצרי מחיקה בתוך מסגרת PCR.
   1. תכנן שני זוגות של פריימרים המגדילים אזורי DNA במעלה הזרם (פריימרים A ו-B) ובמורד הזרם (פריימרים C ו-D) של הגן או האזור שנבחר למחיקה (איור 1B).
   2. ודא שלפריימרים A ו-D יש יותר מ-600 bp במעלה הזרם מההתחלה ובמורד הזרם מהעצירה,....

תוצאות

איור 1: גילוי ביואינפורמטי של אזורים כרומוזומליים ותכן פריימר. (A) סכימה של אזורים כרומוזומליים שזוהו ב-A. hydrophila AH-1 ו-A. piscicola AH-3. A. hydrophila AH-1 flagella glycosylation island מייצג זנים שלפלגלה גליקן שלהם יש רק נגזרת של חומ.......

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
ABI PRISM Big Dye Terminator v. 3.1 ערכת תגובה מוכנה לרצף מחזורים	אפלייד ביוסיסטמס	4337455	משמש לריצוף
AccuPrime Taq DNA פולימראז, נאמנות גבוהה	Invitrogen	12346-086	משמש להגברה של שברי AB, CD ו-AD
אגרוז	Conda-Pronadise	8008	משמש לאלקטרופורזה של DNA
פוספטאז אלקליין, מעי עגל (CIAP)	פרומגה	M1821	משמש להסרת פוספט בקצה 5'
בקטו אגר	בקטון דיקינסון	214010	השתמש לניתוח תנועתיות
במחי	פרומגה	₪1200	משמש להגבלת אנדונוקלאז
BglII	פרומגה	₪1200	משמש להגבלת אנדונוקלאז
מערכת BioDoc-IT Imagin	UVP		תחנת הדמיה ביולוגית המשמשת להדמיית DNA
ביוטק פולימראז	ביוליין	ביו-21040	משמש לסינון מושבות
Cytiva illustra GFX PCR DNA וערכת טיהור רצועות ג'ל	ציטיביה	28-9034-71	משמש לטיהור אמפליקונים PCR ושברי DNA.
EDTA	אפליקציה	131026.1211	משמש לאלקטרופורזה של DNA
קובטות אלקטרופורציה מרווח של 2 מ"מ	VWR	732-1133	משמש לטרנספורמציה
לוריא-ברטאני (ל"ב) מילר אגר	קונדלאב	996	משמש לתרבית Escherichia coli
מרק לוריא-ברטאני (LB) מילר	קונדלאב	1551	משמש לתרבית Escherichia coli
ננו-דרופ ND-1000	ננו-דרופ טכונולוגיות בע"מ		ספקטרופוטומטר המשמש לכימות DNA
ריפמפיצין	אפליקציה	A2220,0005	משמש להזדווגות תלת-הורית
SOC בינוני	Invitrogen	15544034	משמש להתאוששות אלקטרופורציה
T4 DNA ליגאז	Invitrogen	15224017	משמש לתגובת קשירה
Veriti 96 באר Thermal Cycler	אפלייד ביוסיסטמס		משמש לתגובות PCR