הגברה של פלסמיד מתאבד במארח חיידקים

תקציר

מקור: Tomás, J. M., et al. יצירת מוטציות אפס כדי להבהיר את תפקידם של גליקוזילטרנספראזות חיידקיות בתנועתיות חיידקים. J. Vis. Exp. (2022).

סרטון זה מדגים את ההגברה התלויה ביוזם של פלסמיד מתאבד ב - E. coli. הפלסמיד, הנושא גן עמידות לאנטיביוטיקה, משתכפל רק בנוכחות חלבון יוזם המקודד על ידי המארח. לאחר אלקטרופורציה ודגירה במדיום התאוששות, התערובת מצופה על אגר המכיל אנטיביוטיקה. חיידקים עם פלסמיד שורדים, מכיוון שהחלבון היוזם שלו מאפשר ביטוי של הגן העמיד לאנטיביוטיקה של הפלסמיד.

פרוטוקול

1. יצירת מוטציות אפס בגנים של אי הגליקוזילציה של הדגל

הערה: שיטה זו של מוטגנזה מבוססת על החלפה אללית של תוצרי מחיקה בתוך מסגרת של תגובת שרשרת פולימראז (PCR) באמצעות וקטור ההתאבדות pDM428 (GenBank: KC795686.1). שכפול של וקטור pDM4 תלוי בלמבדה פיר , והחילוף האללי המלא נכפה על ידי שימוש בגן sacB הממוקם על הווקטור.

1. בניית מוצרי מחיקה בתוך מסגרת PCR.
   1. תכנן שני זוגות של פריימרים המגדילים אזורי DNA במעלה הזרם (פריימרים A ו-B) ובמורד הזרם (פריימרים C ו-D) של הגן או האזור שנבחר למחיקה (איור 1B).
   2. ודא שלפריימרים A ו-D יש יותר מ-600 bp במעלה הזרם מההתחלה ובמורד הזרם מהעצירה, בהתאמה, של הגן או הגנים שיש למחוק. שני פריימרים אלה צריכים לכלול אתר הגבלה בקצה 5' עבור אנדונוקלאז המאפשר שיבוט ב-pDM4.
      הערה: אתר ההגבלה הכלול בקצה 5' של פריימרים A ו-D לא צריך להיות זהה לאתרים בתוך מגברי AB או CD.
   3. ודא שפריימרים B ו-C נמצאים בתוך הגן שיש למחוק או בתוך הגן הראשון והאחרון, בהתאמה, של האזור שיש למחוק. ודא ששני הפריימרים (B ו-C) נמצאים בתוך המסגרת וממוקמים בין 5-6 קודונים בתוך הגן. יתר על כן, ודא ששני הפריימרים כוללים בקצה 5' רצף משלים של 21 bp (טבלה 1) המאפשר להצטרף לאמפליקונים של ה-DNA AB ו-CD.
   4. גדל את זן Aeromonas הנבחר ב-5 מ"ל של מרק סויה טריפטי (TSB) למשך הלילה (O/N) ב-30 מעלות צלזיוס. השתמש בערכה זמינה מסחרית לטיהור DNA גנומי ופעל לפי הוראות היצרן (טבלת חומרים). כמת 2 מיקרוליטר של ה- DNA המטוהר באמצעות ספקטרופוטומטר.
      הערה: השתמש במים מזוקקים כפולים כריק, כאשר המכשיר מוגדר להקליט ספיגה ב-260 ננומטר. רשום ספיגה עם 2 מיקרוליטר DNA מטוהר 3-5 פעמים וחשב קריאת ספיגה ממוצעת. השתמש בחוק באר-למברט כדי לחשב את ריכוז ה-DNA, כאשר A = Ɛ.c.l. כאשר "A" הוא ספיגה, "Ɛ" הוא מקדם ההכחדה הממוצע המולרי עבור DNA, "c" הוא ריכוז ה-DNA, ו-"l" הוא אורך הנתיב (עיין בהוראות היצרן לגבי אורך הנתיב של כל מכשיר).
   5. השתמש ב-100 ננוגרם של DNA כרומוזומלי מטוהר כתבנית בשתי קבוצות של PCR אסימטריים עם פריימרים A-B ו-C-D (טבלת חומרים). השתמש ביחס מולרי של 10:1 של זוגות פריימר A:B ו-D:C.
      הערה: PCRs אסימטריים מאפשרים העדפה של גדיל אחד של התבנית על פני השני.
   6. נתח את מוצרי ה-PCR על ידי אלקטרופורזה בג'ל אגרוז 1%. השתמש ב-TAE (40 מ"מ Tris-אצטט, 1 מ"מ חומצה אתילנדיאמינטטראצטית (EDTA)) כמאגר ריצה ג'ל והגדרת הספק של 8 וולט/ס"מ. כדי להמחיש DNA, הוסף אתידיום ברומיד (0.5 מיקרוגרם/מ"ל) לג'ל ודמיין את תוצרי ה-PCR באמצעות תחנת הדמיה ביולוגית (טבלת חומרים).
   7. מוציאים את האמפליקונים מהג'ל באמצעות אזמל, מטהרים אותם לפי פרוטוקול היצרן (טבלת חומרים) ומכמתים אותם.
   8. הצטרפו לאמפליקונים AB ו-CD על ידי הרצפים החופפים של 21 bp שלהם בקצה 3' של תוצרי PCR (איור 2). מערבבים 100 ננוגרם מכל אמפליקון (AB ו-CD) בשפופרת PCR עם ריאגנטים PCR (PCR לפני AD), אך ללא פריימרים, ומרחיבים באמצעות תוכנית התרמו-ציקלר. לאחר מכן, הוסף 100 מיקרומטר של פריימרים A ו-D לתגובה (AD PCR) והגביר כשבר יחיד.
   9. לנתח את תוצר ה-PCR (AD amplicon) על ידי אלקטרופורזה בג'ל אגרוז 1% תוך שימוש בתנאים המתוארים בשלב 1.1.6, להוציא את האמפליקון מהג'ל, לטהר אותו בהתאם לפרוטוקול היצרן ולכמת את האמפליקון (טבלת חומרים).
2. בניית פלסמיד רקומביננטי pDM4 עם מחיקה בתוך המסגרת.
   1. גדל תרבית O/N של Escherichia coli cc18λ pir המכיל pDM4 במרק מילר Luria-Bertani (LB) (10 מ"ל) עם כלורמפניקול (25 מיקרוגרם/מ"ל) ב-30 מעלות צלזיוס.
   2. סובבו את התרבית ב-5,000 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס ותלו את הגלולה ב-600 מיקרוליטר של מים מזוקקים סטריליים. בצע מיצוי וטיהור של פלסמיד pDM4 באמצעות ערכת טיהור פלסמיד זמינה מסחרית, בהתאם להוראות הספק (טבלת חומרים).
   3. עכל 1 מיקרוגרם של pDM4 ו-400 ננוגרם של אמפליקון AD למשך שעתיים עם אנדונוקלאז המסוגל לעכל את שני הקצוות של אמפליקון AD ואתר השיבוט של pDM4 (איור 2). עקוב אחר פרוטוקול יצרן האנזים לתנאי התגובה (טבלת חומרים).
   4. נקה את הפלסמיד והאמפליקון המעוכלים באמצעות ערכת טיהור DNA וכימת אותם בהתאם להוראות היצרן (טבלת חומרים).
   5. כדי למנוע הידבקות של ה-pDM4 הליניארי, הסר את קבוצת הפוספט משני הקצוות של 5' באמצעות האנזים פוספטאז אלקליין בהתאם להוראות היצרן (טבלת חומרים). לאחר מכן, נקה את הפלסמיד המטופל וכימת אותו באמצעות ספקטרופוטומטר כמתואר בשלב 1.1.4 (טבלת חומרים).
   6. שלב 150 ננוגרם של pDM4 מעוכל ומטופל בפוספטאז אלקליין עם 95-100 ננוגרם של אמפליקון AD מעוכל ביחס וקטור מולארי: הכנסה של 1:4. הכן את תגובת הקשירה בנפח של 15 מיקרוליטר, בהתאם להוראות היצרן (טבלת חומרים).
   7. דגירה O/N ב-20 מעלות צלזיוס או במהלך סוף השבוע ב-4 מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה, השבת את ה-T4 ליגאז ב-70 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
   8. השתמש בקשירה כדי להכניס את הפלסמיד לזן Escherichia coli MC1061λpir על ידי אלקטרופורציה. השתמש בחיידקים מוכשרים ובקובטות אלקטרופורציה במרווח של 2 מ"מ.
3. הכנת E. coli אלקטרו-מוכשרים ואלקטרופורציה של פלסמיד רקומביננטי pDM4
   1. יש לחסן מושבה אחת של זן E. coli MC1061λpir לתוך מרק מילר Luria-Bertani (LB) ולגדל O/N ב-30 מעלות צלזיוס עם טלטול של 200 סל"ד.
   2. מדללים 2 מ"ל מתרבית החיידקים ב-18 מ"ל מרק LB ודוגרים ב-30 מעלות צלזיוס עם ניעור (200 סל"ד) עד להשגת צפיפות אופטית (OD600) בין 0.4-0.6.
   3. גלולה את תרבית החיידקים על ידי צנטריפוגה ב-5,000 x g ו-4 °C למשך 15 דקות. השליכו את הסופרנטנט ותלו את הכדור ב -40 מ"ל של H₂O מזוקק צונן.
   4. חזור על שלב ניקוי זה פעמיים נוספות כדי להסיר את כל מלחי התרבות. לבסוף, השעו את הגלולה ב-4 מ"ל של H₂O מזוקק צונן והעבירו 1 מ"ל מהמתלה לכל אחד מארבעה צינורות מיקרופוגה חרוטיים של 1.5 מ"ל.
   5. גלולה את תרבית החיידקים על ידי צנטריפוגה ב-14,000 x g ו-4 °C למשך 5 דקות. הסר את הסופרנטנט מבלי להפריע לגלולה ותלה כל כדור ב-100 מיקרוליטר של H₂O מזוקק צונן.
   6. מוסיפים 3-3.5 מיקרוליטר מתערובת הקשירה לכל צינור ודוגרים על קרח למשך 5 דקות. לאחר מכן, העבירו את התוכן של כל צינור לקובטה אלקטרופורציה מקוררת של 2 מ"מ והחילו 2 קילו וולט, 129 Ω וקבוע זמן של כ-5 אלפיות השנייה.
      הערה: מצננים מראש את קוביות האלקטרופורציה על קרח. שמור על החיידקים על הקרח במהלך כל ההליך.
   7. לאחר האלקטרופורציה, הוסף 250 מיקרוליטר של מדיום SOC (מרק סופר אופטימלי עם דיכוי קטבוליט) לכל אחת מארבע הקובטות כדי לשחזר את תכולתן, להעביר אותן לצינור תרבית (כ-1 מ"ל), ולדגור למשך שעה אחת ב-30 מעלות צלזיוס עם ניעור (200 סל"ד).
   8. צלחת את התאים שעברו טרנספורמציה על צלחות אגר לוריא-ברטאני (LB) בתוספת כלורמפניקול (25 מיקרוגרם/מ"ל) כדי להבטיח שלכל המושבות הגדלות על הצלחת יש את עמוד השדרה של הפלסמיד.

טבלה 1: פריימרים המשמשים לבניית מוטציות אפס. אזורים חופפים בפריימרים B ו-C מסומנים בקו תחתון. אתר BamHI מודגש בפריימרים A ו-D.

שם פריימר	רצף בכיוון 5' עד 3'	משמש ל
א. פיסיקולה AH-3
א-פלגי1	CGCGGATCCGACTGTACCCGTTTCAATCA	מוטנט FGI
בי-פלג'י1	CCCATCCACTAAACTTAAACAGATCACCTCGAACTCGAAA
סי-פלג'י12	TGTTTAAGTTTAGTGGATGGGGGAACCTTAAATGCCATGA
D-FLGI12	CGCGGATCCCAGTCTTCAGCTTCCATCC
E-FLGI1	ACCCGCTTCATTCGCTAT
פ-פלגי12	TCCGATTTTCTGACTCAGGG
א-FGI4	CGCGGATCCGATGCGTACGCTAATATGAA	מוטציה FGI-4
בי-פגי4	CCCATCCACTAAACTTAAACACATATTATTTTGCCCCTGAT
C-FGI4	TGTTTAAGTTTAGTGGATGGGGAGCTAATCACTCGTTT
D-FGI4	CGCGGATCCACATATCAACCCCCAAC
E-FGI4	ATTTCCCTGCCAAATACG
פ-פגי4	CCTGCCAACAGGATGTAAG
וקטור pDM4
pDM4for	AGTGATCTTCCGTCACAGG	הוספות לווקטור pDM4
pDM4rev	AAGGTTTAACGG TTGTGGA

תוצאות

איור 1: גילוי ביואינפורמטי של אזורים כרומוזומליים ותכן פריימר. (A) סכימה של אזורים כרומוזומליים שזוהו ב-A. hydrophila AH-1 ו-A. piscicola AH-3. A. hydrophila AH-1 flagella glycosylation island מייצג זנים שלפלגלה גליקן שלהם יש רק נגזרת של חומ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
ABI PRISM Big Dye Terminator v. 3.1 ערכת תגובה מוכנה לרצף מחזורים	אפלייד ביוסיסטמס	4337455	משמש לריצוף
AccuPrime Taq DNA פולימראז, נאמנות גבוהה	Invitrogen	12346-086	משמש להגברה של שברי AB, CD ו-AD
אגרוז	Conda-Pronadise	8008	משמש לאלקטרופורזה של DNA
פוספטאז אלקליין, מעי עגל (CIAP)	פרומגה	M1821	משמש להסרת פוספט בקצה 5'
בקטו אגר	בקטון דיקינסון	214010	השתמש לניתוח תנועתיות
במחי	פרומגה	₪1200	משמש להגבלת אנדונוקלאז
BglII	פרומגה	₪1200	משמש להגבלת אנדונוקלאז
מערכת BioDoc-IT Imagin	UVP		תחנת הדמיה ביולוגית המשמשת להדמיית DNA
ביוטק פולימראז	ביוליין	ביו-21040	משמש לסינון מושבות
Cytiva illustra GFX PCR DNA וערכת טיהור רצועות ג'ל	ציטיביה	28-9034-71	משמש לטיהור אמפליקונים PCR ושברי DNA.
EDTA	אפליקציה	131026.1211	משמש לאלקטרופורזה של DNA
קובטות אלקטרופורציה מרווח של 2 מ"מ	VWR	732-1133	משמש לטרנספורמציה
לוריא-ברטאני (ל"ב) מילר אגר	קונדלאב	996	משמש לתרבית Escherichia coli
מרק לוריא-ברטאני (LB) מילר	קונדלאב	1551	משמש לתרבית Escherichia coli
ננו-דרופ ND-1000	ננו-דרופ טכונולוגיות בע"מ		ספקטרופוטומטר המשמש לכימות DNA
ריפמפיצין	אפליקציה	A2220,0005	משמש להזדווגות תלת-הורית
SOC בינוני	Invitrogen	15544034	משמש להתאוששות אלקטרופורציה
T4 DNA ליגאז	Invitrogen	15224017	משמש לתגובת קשירה
Veriti 96 באר Thermal Cycler	אפלייד ביוסיסטמס		משמש לתגובות PCR