בידוד של חיידקים גראם-שליליים עם החדרת טרנספוזון גנומי

תקציר

מקור: Kazi, M. I., et. al., יצירת ספריות החדרת טרנספוזונים בחיידקים גראם-שליליים לריצוף תפוקה גבוהה. J. Vis. Exp. (2020)

סרטון זה מדגים את הבחירה, הכימות והשימור של חיידקים נמענים גראם-שליליים הנושאים החדרות טרנספוזונים על סמך עמידות לקנמיצין.

פרוטוקול

יצירת ספריית המוטציות החיידקיות הסופית

1. הפשירו חלק מההזדווגות הקפואה על הקרח.
2. הזדווגות צלחות על לוחות אגר לוריא-ברטאני (LB) בקוטר 150 מ"מ בתוספת קנמיצין המבוססת על יחידות יוצרות מושבה (CFU) המחושבות בשלב 3.1. כוונן את עוצמת הקול עם LB כדי להניב 13,333 מושבות לכל 150 מיקרוליטר לפני הציפוי.
   הערה: ספירת ה-CFU כאן נקבעה כ-10⁵ CFU/mL, כך שנפח ההזדווגות הותאם לקבלת 13,333 מושבות לכל צלחת. זה יספק מספר אופטימלי של מושבות על 30 לוחות עבור ספריית מוטאנטים ברזולוציה גבוהה מבלי להעמיס על הצלחות.
3. השתמשו בחרוזי זכוכית סטריליים כדי לפזר 150 מיקרוליטר של דילול לצלחת על לוחות אגר לוריא-ברטאני בגודל 30 x 150 מ"מ בתוספת קנמיצין כדי להשיג 400,000 מושבות (איור 1C).
   הערה: ניתן להשתמש במוטות סטריליים או בכל סוג של כלי פיזור סטרילי (כלומר, חרוזי זכוכית) כדי להפיץ את החיידקים על צלחות.
4. השלך את הצינור המשומש המכיל הזדווגות עודפת.
   הערה: מחזורי הקפאה/הפשרה מוסיפים לחצים סלקטיביים על תרבית החיידקים, מה שיכול להטות את תוצאות ניסוי Tn-seq. השתמש במנה חדשה בכל פעם.
5. דגרו צלחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 14 שעות.
   הערה: זמן הדגירה מותאם למניעת צמיחת יתר (מושבות נוגעות). מוצע למזער את הצמיחה על ידי הפחתת זמן הדגירה.

הערכת צפיפות הספרייה ואיגום לאחסון

1. ספרו CFUs על כל צלחת כדי להעריך את סך המוטציות בספריית הטרנספוזונים. ספרו 20% מ-3 לוחות לפחות כדי לקבוע את אומדן ספירת המושבה עבור כל קבוצת הלוחות (איור 2A). ודא שהמושבות אינן נוגעות במושבה אחרת.
2. לאחר חישוב תפוקת המושבה המשוערת, הוסיפו 3-5 מ"ל LB (או יותר במידת הצורך) לכל צלחת וגרדו את החיידקים באמצעות כלי גירוד סטרילי. הערה: לולאות חיסון סטריליות שימשו לגירוד יעיל של צלחות.
3. אסוף תרחיפי חיידקים מכל הלוחות לצינורות חרוטיים של 50 מ"ל (איור 1D). זה ידרוש צינורות חרוטיים מרובים של 50 מ"ל, לפחות 3.
4. תרחיף חיידקים מאגר גלולה באמצעות צנטריפוגה ב-5,000 x גרם למשך 7 דקות.
5. יש להשליך את הסופרנטנט ולהשעות מחדש את הגלולה ב-5 מ"ל של LB בתוספת 30% גליצרול.
6. Aliquot 1 מ"ל מספריית הטרנספוזון לקריוביאלים ומאחסנים בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.

תוצאות

איור 1: סכמטי של בניית ספריית מוטנטים של טרנספוזונים. (A) צימוד חיידקים. הזן "התורם", המקודד את מנגנון הטרנספוזיציה, עורבב עם הזן "המקבל". התערובת נצפתה על לוחות אגר לוריא-ברטאני (LB) ואפשרה לה להזדווג למשך שעה אחת. הפלסמיד הנושא את מנגנון הטרנ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
צלחות פטרי 150 מ"מ x 15 מ"מ	קורנינג	351058
צינורות צנטריפוגה פוליפרופילן סטריליים חרוטיים 50 מ"ל	פישר סיינטיפיק	12-565-271
Acinetobacter baumannii ATCC 17978	ATCC	לא ישים	AmpS, קנזס
Escherichia coli MFD Dap-	לא ישים	לא ישים	DAP Auxotroph, דורש 600 מ"מ בתוספת אקסוגנית DAP כדי לגדול. מכיל מכונות RP4 להעברת פלסמיד. מנשא ל-JNW68 (36).
בקבוקונים קריוגניים עם הברגה חיצונית	קורנינג	09-761-71
חרוזי זכוכית	קורנינג	72684
גליצרול	פישר סיינטיפיק	G33
לולאות חיסון	פישר סיינטיפיק	22-363-602	כלי גירוד
קנמיצין	פישר סיינטיפיק	BP906	בשימוש במינון 25 מ"ג/ליטר
LB אגר, מילר	פישר סיינטיפיק	BP1425
מרק LB, מילר	פישר סיינטיפיק	BP1426
תמיסת מלח חוצצת פוספט, תמיסת 10X	פישר סיינטיפיק	BP39920	מדולל ל-1X