ספיגת DNA המושרה על ידי מיומנות בסטפילוקוקוס זהוב

תקציר

מקור: Cafini, F., et.al. מתודולוגיה לחקר העברת גנים אופקית בסטפילוקוקוס זהוב. J. Vis. Exp. (2017)

סרטון זה מדגים קליטת DNA המושרה על ידי מיומנות בסטפילוקוקוס זהוב באמצעות טרנספורמציה טבעית. זן רגיש לכלורמפניקול המהונדס לבטא באופן מכונן גורם סיגמא מתורבת בתנאים מגבילים של חומרים מזינים כדי לשפר את היכולת, ולאחר מכן מודגר עם DNA תורם הנושא גן עמיד. העברת גנים מוצלחת מאושרת על ידי גידול סלקטיבי של טרנספורמנטים עמידים לכלורמפניקול.

פרוטוקול

1. טרנספורמציה טבעית

הערה: הנגזרת N315, N2-2.1 שימשה כמקבלת. בזן זה, לוקוס ה-sigH שוכפל כך שיבטא באופן קונסטיטוטיבי את SigH. אם סמן ההתנגדות שיש להעביר אינו כלורמפניקול, ניתן להשתמש ב-pRIT-sigH (Cm^R) כדי לבטא SigH. פלסמיד מטוהר או תמצית DNA מלא מ- S. aureus COL-45 הנרכש על ידי CFR משמש כ- DNA התורם לטרנספורמציה.

1. הכנת DNA של התורם
   1. יש לטפח את COL-45 למשך הלילה עם ניעור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בבקבוק של 300 מ"ל המכיל 50 מ"ל של מרק סויה טריפטי (TSB) בתוספת 32 מ"ג/ליטר כלורמפניקול. תרבית E. coli HST04 הנושאת פלסמיד pHY300 ^(TetR) כדי לחלץ את הפלסמיד לניסוי הבקרה.
      הערה: HST04 (dam^-/dcm^-) חסר את הגנים של מתילאז DNA. ניתן להשתמש בזנים קונבנציונליים אחרים עם מתילאזות DNA להכנת תורם ה-DNA, מכיוון שמצב המתילציה של ה-DNA אינו משפיע על יעילות הטרנספורמציה. לחלופין, פלסמיד pT181 מטוהר מזן S. aureus COL יכול לשמש גם כבקרה חיובית לבדיקת הטרנספורמציה.
   2. אוספים את התאים על ידי צנטריפוגה (8,000 x גרם למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס).
   3. חלץ את הפלסמידים באמצעות ערכת מיצוי DNA פלסמיד או שיטת טיהור DNA קונבנציונלית לטיהור ה-DNA כולו.
   4. כמת את ה-DNA המטוהר על ידי ספקטרומטר ושמור אותו ב-4 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
      הערה: השתמש בתכשיר DNA טרי לבדיקת הטרנספורמציה, בדרך כלל בן פחות משבוע. תכשירי DNA ישנים מפחיתים את יעילות הטרנספורמציה.
2. בדיקת טרנספורמציה
   1. תרבית התא הנמען (N2-2.1) למשך הלילה ב-5 מ"ל TSB ב-37 מעלות צלזיוס עם טלטול.
   2. מעבירים 0.5 מ"ל מתרבית הלילה לצינור של 1.5 מ"ל. לזרז את התאים על ידי צנטריפוגה (10,000 x גרם למשך דקה אחת בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס).
   3. השעו את התאים עם 10 מ"ל של מדיום CS2 בצינור של 50 מ"ל.
      הערה: מדיום CS2 הוא מדיום סינתטי שלם הגורם ליכולת לטרנספורמציה טבעית ב-S. aureus. אמצעי מעבדה סטנדרטיים אחרים, כגון TSB או עירוי לב מוח (BHI), אינם מתאימים לטרנספורמציה.
   4. מגדלים את החיידקים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם ניעור (180 סל"ד) עד לשלב האקספוננציאלי המאוחר (כ-8 שעות).
   5. קצרו את התאים על ידי צנטריפוגה (5,000 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס).
   6. השעו מחדש את התאים ב -10 מ"ל של מדיום CS2 טרי.
   7. הוסף 10 מיקרוגרם של פלסמיד מטוהר או DNA גנום (שלב 1.1.4) לתרחיף התאים. יש לנער בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-180 סל"ד למשך שעתיים וחצי.
      הערה: זמני דגירה קצרים יותר עם DNA (<2.5 שעות) מביאים לתדירות טרנספורמציה נמוכה יותר.
   8. אוספים תאים על ידי צנטריפוגה (5,000 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס).
   9. השעו מחדש את התאים ב -10 מ"ל של מדיום BHI. מערבבים את תרחיף התאים עם 90 מ"ל של תוסף אגר BHI מומס (55 מעלות צלזיוס) עם 32 מ"ג/ליטר כלורמפניקול (או 5 מ"ג/ליטר טטרציקלין בניסוי הבקרה). יוצקים את התערובת לצלחות פטרי 90 מ"מ. מצננים במהירות ונותנים לאגר להתמצק.
   10. דגרו את הצלחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך יומיים.
   11. שכפל מושבות שנוצרו (טרנספורמציה) על ידי העברת המושבות (באמצעות קיסמים) לצלחות אגר BHI חדשות המכילות את האנטיביוטיקה המתאימה כדי לאשר את מאפייני העמידות שלהן. אשר את גן העמידות הנרכש (cfr או tetM) על ידי PCR מושבה.

חומרים