בדיקה מבוססת נוזל Multiwell לסינון C. elegans Knockdowns

תקציר

מקור: Anderson, Q. L. et al. C. elegans Pathosystem בעל תפוקה גבוהה, תכולה גבוהה, מבוסס נוזל. J. Vis. Exp. (2018)

סרטון זה מדגים שיטת סינון בעלת תפוקה גבוהה המשתמשת ב-Caenorhabditis elegans כדי לחקור הפלות גנים במהלך אינטראקציות מארח-פתוגן. הוא מתאר את הנוהל להכנת תולעי נוקדאון והעברתן ללוחות בדיקה כדי להעריך את ההשפעות של הרג תולעים הנגרמת על ידי פתוגנים.

פרוטוקול

1. התאמה לבדיקת זנים או נוקדאונים מרובים של Caenorhabditis elegans (הגדרת מסך הפרעות חומצה ריבונוקלאית (RNAi))

הערה: זהו מסך RNAi המתואר להגדרת צלחת 24 בארות.

1. הוסף 1 מ"ל של S בזל לכל באר של צלחת של 24 בארות המכילה תולעים שנזרעו ב-RNAi. מערבבים בעדינות תולעים על ידי ניעור הצלחת, ואז מעבירים תולעים לצלחת ריקה וסטרילית עם 24 בארות עמוקות. אפשר לתולעים להתיישב בכוח הכבידה (~5 דקות).
2. שואב סופרנטנט ומשאיר כ -1 מ"ל. הוסף 7 מ"ל של S בזל לכל באר.
3. חזור על שלבים 1.1 - 1.2 לפחות פעמיים נוספות. לאחר הכביסה הסופית, שאפו סופרנטנט והשאירו כ -400 מיקרוליטר.
4. באמצעות פונקציית Resampler של ממיין התולעים, מיין 22 תולעים ממתלה התולעת של 24 בארות לכל באר של צלחת של 384 בארות (כל באר של צלחת של 24 בארות מניבה 8 - 12 בארות של צלחת של 384 בארות).
   1. כדי למנוע רעב, יש להכניס חיידקי פיפטה לצלחות של 384 בארות (זן המשמש אך ורק כמזון, כגון OP50, או זן פתוגני) לפני המיון.
5. לאחר שהתולעים מוינו לתוך צלחת 384 הבארות, הוסיפו מולקולות קטנות או חומרים ספציפיים אחרים לניסוי.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
COPAS FP BioSorter	יוניון ביומטריקה		ציטומטר זרימת אובייקט גדול/סדרן תולעים
24 בלוק RB עמוק	תרמו פישר סיינטיפיק	CS15124
צלחת 384 באר	גריינר ביו-וואן	MPG-781091
מצע גדילת נמטודות (NGM)			כמות לליטר: 18 גרם אגר, 3 גרם NaCl, 2.5 גרם פפטון, 1 מ"ל סידן כלורי (1 מ'), 1 מ"ל מגנזיום גופרתי (1 מ'), 25 מ"ל מאגר פוספט ו-973 מ"ל מים מילי-Q
S בזל			כמות לליטר: 5.85 גרם NaCl, 6 גרם אשלגן פוספט מונו-בסיסי, 1 גרם אשלגן פוספט דו-בסיסי, ו-1 ליטר מים מילי-Q
אגר	מדעי החיים האיולוגיים	א0930
NaCl	מדעי החיים האיולוגיים	S5000
פפטון	מדעי החיים האיולוגיים	עמ' 3300
סידן כלורי	מדעי החיים האיולוגיים
מגנזיום גופרתי	פישר סיינטיפיק	M63-500
מאגר פוספט			כמות לליטר: 132 מ"ל אשלגן פוספט דו-בסיסי (1M) ו-868 מ"ל אשלגן פוספט מונו-בסיסי (1M)
אשלגן פוספט מונו-בסיסי	אקרוס אורגניקס	7778-77-0
אשלגן פוספט דו-בסיסי	מדעי החיים האיולוגיים	עמ' 5100
זני חיידקים
P. aeruginosa (PA14)
מזון-על של אי קולי (OP50)
חיידקים המבטאים RNAi של E. coli (HT115)
זן תולעת
glp-4(bn2) (Beanan and Strome, 1992, PMID: 1289064)