בדיקה מבוססת נוזל Multiwell לסינון C. elegans Knockdowns

Abstract

מקור: Anderson, Q. L. et al. C. elegans Pathosystem בעל תפוקה גבוהה, תכולה גבוהה, מבוסס נוזל. J. Vis. Exp. (2018)

סרטון זה מדגים שיטת סינון בעלת תפוקה גבוהה המשתמשת ב-Caenorhabditis elegans כדי לחקור הפלות גנים במהלך אינטראקציות מארח-פתוגן. הוא מתאר את הנוהל להכנת תולעי נוקדאון והעברתן ללוחות בדיקה כדי להעריך את ההשפעות של הרג תולעים הנגרמת על ידי פתוגנים.

Protocol

1. התאמה לבדיקת זנים או נוקדאונים מרובים של Caenorhabditis elegans (הגדרת מסך הפרעות חומצה ריבונוקלאית (RNAi))

הערה: זהו מסך RNAi המתואר להגדרת צלחת 24 בארות.

1. הוסף 1 מ"ל של S בזל לכל באר של צלחת של 24 בארות המכילה תולעים שנזרעו ב-RNAi. מערבבים בעדינות תולעים על ידי ניעור הצלחת, ואז מעבירים תולעים לצלחת ריקה וסטרילית עם 24 בארות עמוקות. אפשר לתולעים להתיישב בכוח הכבידה (~5 דקות).
2. שואב סופרנטנט ומשאיר כ -1 מ"ל. הוסף 7 מ"ל של S בזל לכל באר.
3. חזור על שלבים 1.1 - 1.2 לפחות פעמיים נוספות. לאחר הכביסה הסופית, שאפו סופרנטנט והשאירו כ -400 מיקרוליטר.
4. באמצעות פונקציית Resampler של ממיין התולעים, מיין 22 תולעים ממתלה התולעת של 24 בארות לכל באר של צלחת של 384 בארות (כל באר של צלחת של 24 בארות מניבה 8 - 12 בארות של צלחת של 384 בארות).
   1. כדי למנוע רעב, יש להכניס חיידקי פיפטה לצלחות של 384 בארות (זן המשמש אך ורק כמזון, כגון OP50, או זן פתוגני) לפני המיון.
5. לאחר שהתולעים מוינו לתוך צלחת 384 הבארות, הוסיפו מולקולות קטנות או חומרים ספציפיים אחרים לניסוי.

Materials