הערכת תמותה הנגרמת על ידי חיידקים פתוגניים בזחלי C. elegans

תקציר

מקור: Anderson, Q. L., et al. C. elegans Pathosystem בעל תפוקה גבוהה, תכולה גבוהה, מבוסס נוזל. J. Vis. Exp. (2018)

הסרטון מדגים בדיקה מבוססת נוזל שבה זחלי C. elegans מהונדסים גנטית נחשפים לחיידקים פתוגניים במיקרו-צלחת. רעלנים חיידקיים המופרשים למדיום גורמים ללחץ ולמוות של המארח. צבע פלואורסצנטי מכתים תולעים מתות, ומאפשר כימות מבוסס הדמיה של התמותה כדי להעריך את הרגישות או העמידות הגנטית.

פרוטוקול

1. הגדרת בדיקת הרג נוזלי (פרוטוקול בסיסי)

הערה: זהו פרוטוקול לזן חיידקים אחד ומקור אחד לתולעים.

1. בעזרת מגרד תאים, הסר את Pseudomonas aeruginosa מצלחת הרג איטי או SK והשהה מחדש ב~ 5 מ"ל של S Basal. התרחב במידת הצורך. למדוד את הצפיפות האופטית של תרחיף החיידקים באמצעות ספקטרופוטומטר (OD₆₀₀)
2. הכן 24 מ"ל של מלאי מדולל של P. aeruginosa ב-S Basal ב-OD₆₀₀ ≈-0.09 (ריכוז סופי פי 3). ראה 4.6.2 לתוכן הסופי לבאר, וקנה מידה של נפח דילול החיידקים בהתאם.
3. יש להוסיף 21 מ"ל של חומר נוזלי Slow Kill (3 גרם NaCl, 3.5 גרם פפטון/ליטר בתוספת CaCl₂ ו-MgSO₄ לריכוז סופי של 1 מ"מ). בעזרת פיפטה רב-ערוצית, העבירו 45 מיקרוליטר של חיידקים ומדיה לכל באר של צלחת של 384 בארות.
4. שטפו תולעים ממקורן לצינור חרוטי של 50 מ"ל ואפשרו לתולעים להתיישב בכוח הכבידה. שואבים סופרנטנט ל -5 מ"ל. השעיה בסך הכל 50 מ"ל S בזאלי.
5. חזור על שלב 1.4 פעמיים.
6. בעזרת ממיין תולעים, מיין כ-22 תולעים לכל באר של צלחת 384 הבארות.
   הערה: ההתקנה מפילה כל תולעת ב~1.1 מיקרוליטר של נוזל. 22 תולעים יסתכמו ב-25 מיקרוליטר, מה שמביא את נפח הבדיקה הכולל ל-70 מיקרוליטר לבאר.
   1. ההרכב הסופי של כל באר מורכב מ-70 מיקרוליטר. 45 מיקרוליטר מנפח זה מתווסף כמדיום חיידקי (0.03 OD₆₀₀ חיידקים ב-24 מיקרוליטר S בזאלי, ו-21 מיקרוליטר SK בתוספת CaCl₂ ו-MgSO₄). 25 מיקרוליטר האחרים מתווספים עם 22 התולעים.
   2. אם הממיין המשמש כאן (ראה טבלת חומרים) אינו זמין, ניתן לדלל תולעים לריכוז סופי של 1 תולעת/מיקרוליטר ב-S בזל ולזרוק 25 מיקרוליטר לבאר באמצעות פיפטה רב-ערוצית. עם זאת, התוצאות עשויות להראות שונות מוגברת. לחלופין, ניתן להשתמש במתקן נוזלים פריסטלטי, כפי שתואר על ידי ליונג ועמיתיו.
7. לאחר מיון התולעים לצלחת 384 הבארות, אטמו את הצלחת בסרט חדיר גז ודגרו את הצלחות בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך 24 - 48 שעות.
8. בזמן הרצוי, השתמש במכונת כביסה של מיקרופלייט כדי לשטוף את צלחת 384 הבארות עם S Basal בסך הכל 5 פעמים.
   1. לאחר הכביסה השנייה, שאפו את רוב המדיה, והשאירו ~20 מיקרוליטר.
9. לאחר הכביסה הסופית, שאפו סופרנטנט עד 20 מיקרוליטר. הוסף 50 מיקרוליטר של כתם חומצת גרעין של 0.98 מיקרומטר (ראה טבלת חומרים)/באר של צלחת 384 בארות, לריכוז סופי של 0.7 מיקרומטר.
10. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 12 - 16 שעות. צבע זה רק יכתים תולעים מתות. לאחר תקופת הדגירה הרצויה, שטפו צלחות באמצעות מכונת הכביסה של המיקרופלייט כדי להסיר כתם עודף (מינימום 3 כביסות).
11. לרכישת נתונים, השתמש בספקטרופוטומטר או במיקרוסקופ אוטומטי כדי לדמות הן את האור המועבר והן את הקרינה (עירור של 531 ננומטר ופליטה של 593 ננומטר).

חומרים