תרבית ותחזוקה של חיידקים המבטאים RNAi

תקציר

מקור: Anderson, Q. L., et al., A תפוקה גבוהה, תכולה גבוהה, מבוססת נוזל C. elegans Pathosystem. J. Vis. Exp. (2018)

סרטון זה מדגים את הכנת חיידקי הפרעות RNA (RNAi) הנושאים פלסמידים כדי לעכב ביטוי גן מטרה. הוא מתאר את שלבי הבחירה, הגידול והאינדוקציה של חיידקי RNAi לייצור לוחות המבטאים dsRNA לבדיקות במורד הזרם.

פרוטוקול

1. הכנת חיידקי הפרעות RNA (RNAi)

1. פס או העביר זנים רצויים של חיידקים המכילים RNAi על צלחות אגר מרק ליזוגני (LB) המכילות אנטיביוטיקה מתאימה (קרבניצילין ב-100 מיקרוגרם/מ"ל וטטרציקלין ב-15 מיקרוגרם/מ"ל עבור ספריות Ahringer ו-Vidal) ממלאי קפוא.
   הערה: בעת עבודה עם חיידקים לא פתוגניים, השתמש בארון בטיחות ביולוגי ברמת בטיחות ביולוגית (BSL)-2 A/B או במכסה זרימה למינרי BSL-1 כדי להבטיח סטריליות של התרביות וכדי למזער את הסיכוי לזיהום צולב של הספרייה.
2. דגרו צלחות למשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
3. אחסן את הצלחות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד שבועיים.
   1. לאחר שבועיים, השליכו את הצלחות והחליפו אותן בצלחות טריות.
4. בדוק מספר זני RNAi במקביל על ידי חיסון בנפרד של מושבה בודדת מכל שיבוט לתוך 4 מ"ל של LB בתוספת קרבניצילין בבאר אחת של צלחת באר עמוקה של 24 בארות או לתוך מבחנה סטרילית.  
   הערה: דווח כי טטרציקלין מפחית את יעילות ה-RNAi. אל תשתמש בו במדיום זה.
5. הנח צלחות באר בעומק 24 בארות לתוך חממת טלטול המותאמת לצלחות מרובות בארות ודגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות תוך ניעור ב-950 סל"ד. הערה: קשה להשיג גידול חיידקים אחיד בצלחות מרובות בארות באמצעות חממת טלטול קונבנציונלית. החממה הרועדת צריכה להיות מסוגלת לרעוד במינימום של 750 סל"ד על מנת שהתרבויות יגדלו כראוי. בהיעדר שייקר מיוחד, ניתן לגדל כל תרבות בצינור בודד. ניתן להעביר תרביות לצלחת 24 בארות לצנטריפוגה לאחר מכן.
6. אוספים חיידקים על ידי צנטריפוגה למשך 5 דקות במינון של 2,000 x גרם.
7. שפכו את הסופרנטנט על ידי היפוך הצלחת וניעור נמרץ. השעיה מחדש של חיידקי RNAi ב-100 מיקרוליטר של S בזאלי (5.85 גרם נתרן כלורי, NaCl; 1 גרם דיפוטסיום פוספט, K₂HPO₄; 6 גרם מונופוטסיום פוספט, KH₂PO₄ מומס ל-1 ליטר מים טהורים במיוחד ומעוקר על ידי חיטוי).
8. פיפטה השעתה חיידקים למספר מתאים של בארות של צלחת NGM מרובת בארות (מצע גידול נמטודות, 3 גרם NaCl, 2.5 גרם פפטון, 1 מ"מ סידן כלורי, CaCl₂; 1 מ"מ מגנזיום גופרתי, MgSO₄; 25 מ"ל של חוצץ פוספט (כמות לליטר: 132 מ"ל של K₂HPO₄ (1 מ') ו-868 מ"ל של KH₂PO₄ (1M)), ו-18 גרם אגר לליטר מים) בתוספת IPTG (איזופרופיל β-D-1-thiogalactopyranoside; ריכוז סופי של 1 מ"מ) וקרבניצילין (ריכוז סופי של 100 מיקרוגרם/מ"ל).
   1. השתמש ב-3.5 מ"ל של מדיה NGM לבאר של צלחת של 6 בארות, 1 מ"ל לבאר של צלחת של 24 בארות, או 150 מיקרוליטר לבאר של צלחת של 96 בארות.
   2. השתמש ב-100 מיקרוליטר/באר חיידקים עבור צלחת של 6 בארות, 50 מיקרוליטר / באר עבור צלחת של 24 בארות, או 20 מיקרוליטר / באר עבור צלחת של 96 בארות. יש להניח לייבוש.
      הערה: הייבוש מתבצע בדרך כלל במנדף זרימה סטרילי כדי לקדם ייבוש מהיר ואחיד. ייבוש אחיד חשוב מאוד. הימנע מייבוש יתר, מכיוון שסדקים באגר מעודדים התחפרות של תולעים. זה מוביל לאובדן תולעים ולסתימה פוטנציאלית של מערכות טיפול בנוזלים.
9. השתמש מיד בצלחות המוכנות או אחסן אותן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד שבועיים לשימוש מאוחר יותר.
   הערה: כדי למנוע התייבשות צלחות, ניתן לאטום אותן בסרט פרפין מפלסטיק או להניח אותן בכלי אטום היטב עם מגבות נייר לחות.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
24 בלוק RB עמוק	תרמו פישר סיינטיפיק	CS15124
מצע גידול נמטודות (NGM)			כמות לליטר: 18 גרם אגר, 3 גרם נתרן כלורי, 2.5 גרם פפטון, 1 מ"ל סידן כלורי (1 מ'), 1 מ"ל מגנזיום גופרתי (1 מ'), 25 מ"ל מאגר פוספט ו-973 מ"ל מים מילי-Q
מרק ליזוגני (LB)	מדעי החיים האיולוגיים	L1520
S בזל			כמות לליטר: 5.85 גרם נתרן כלורי, 6 גרם מונופוטסיום פוספט, 1 גרם דיפוטסיום פוספט וליטר מים מילי-Q
אגר	מדעי החיים האיולוגיים	א0930
נתרן כלורי	מדעי החיים האיולוגיים	S5000
פפטון	מדעי החיים האיולוגיים	עמ' 3300
סידן כלורי	מדעי החיים האיולוגיים
מגנזיום גופרתי	פישר סיינטיפיק	M63-500
מאגר פוספט			כמות לליטר: 132 מ"ל דיפוטסיום פוספט (1 מ ') ו -868 מ"ל מונופוטסיום פוספט (1 מ ')
מונופוטסיום פוספט	אקרוס אורגניקס	7778-77-0
דיפוטסיום פוספט	מדעי החיים האיולוגיים	עמ' 5100