ביטוי אופרון הזוהר בחיידקים ביולומינסנט ימיים

תקציר

מקור: Brodl, E., et al. באתרו מדידה ומתאם של צפיפות תאים ופליטת אור של חיידקים ביו-לומינסצנטיים. J. Vis. Exp. 1 (2018)

סרטון זה מדגים את גידול חיידקי ביולומינסנט ימיים כדי לצפות בהפעלה בתיווך חישת מניין של אופרון הזוהר, המאפשר ניטור בזמן אמת של ביטוי גנים ופליטת אור למחקרים בתקשורת מיקרוביאלית ובקרה גנים.

פרוטוקול

1. ביטוי של זני ביולומינסנט חיידקיים

הערה: זנים ביולוגיים של חיידקים דורשים מדיום גידול ספציפי / מדיום מי ים מלאכותי לצמיחה וייצור אור.

1. הכן מדיום מי ים מלאכותי, המורכב משני רכיבי מדיום שהוכנו בנפרד.
   הערה: הכמויות הבאות מיועדות ל-1 ליטר מדיום נוזלי או 1 ליטר מדיום אגר.
   1. עבור מדיום מי הים המלאכותיים, שקלו את המלחים הבאים: 28.13 גרם NaCl (נתרן כלורי), 0.77 גרם KCl (אשלגן כלורי), 1.60 גרם CaCl₂ · 2H₂O (סידן כלורי דיהידרט), 4.80 גרם MgCl₂ · 6H₂O (מגנזיום כלוריד הקסהידרט), 0.11 גרם NaHCO₃ (נתרן ביקרבונט), ו-3.50 גרם MgSO₄ · 7H₂O (מגנזיום סולפט הפטהידרט).
   2. מוסיפים 1 ליטר מים מזוקקים וממיסים את כל הרכיבים.
   3. עבור מדיום LB (Luria-Bertani), שקלו את המרכיבים הבאים: 10 גרם תמצית שמרים, 10 גרם פפטון, ולצלחות אגר 20 גרם אגר נוספים.
   4. מוסיפים 250 מ"ל מי ברז וממיסים רכיבים.
   5. חיטוי שני המדיה המוכנה בנפרד ב-121 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
   6. עבור צלחות אגר, שלבו 250 מ"ל של מדיום LB עם 750 מ"ל של מדיום מי ים מלאכותי מיד לאחר החיטוי והכינו צלחות.
   7. עבור מדיום נוזלי, שלב 250 מ"ל של מדיום LB עם 750 מ"ל של מדיום מי ים מלאכותי מיד לאחר החיטוי או כאשר הוא מקורר.
      הערה: מדיום מי הים המלאכותי עלול להיות עכור באמצעות משקעי מלח.
2. פס את זני החיידקים על צלחות אגר בינוניות של מי ים מלאכותיים ודגירה למשך הלילה בטמפרטורה של 24 - 30 מעלות צלזיוס.
   הערה: אחסון לטווח ארוך של זני חיידקים מושג בדרך כלל באמצעות הקפאת מלאי גליצרול של תרבית החיידקים. יש תמיד לפספס זנים על צלחות אגר תחילה כדי להבטיח תנאי התחלה אחידים לכל הזנים, לפני השימוש בתרביות נוזליות, עקב שלב פיגור בצמיחה לאחר ההפשרה.
3. הכן ONC (תרבית לילה) על ידי חיסון 100 מ"ל של מדיום מי ים מלאכותי עם מושבה אחת מהצלחת. דגרו את ה-ONC בטמפרטורה של 24 - 30 מעלות צלזיוס ו-120 סל"ד בשייקר אינקובטור למשך הלילה.
4. חיסון 800 מ"ל של מדיום מי ים מלאכותי עם 8 מ"ל ONC.
5. דגרו על תאי החיידקים בטמפרטורה של 24 - 30 מעלות צלזיוס ו -120 סל"ד בשייקר אינקובטור.
   הערה: פרופיל עוצמת האור של חיידקים ביולומינסנטים משתנה מאוד עם הטמפרטורה. בהתאם למנגנוני הרגולציה של ייצור האור של זן החיידקים המתאים, פליטת האור עשויה להתחיל לאחר כ-1 - 6 שעות.
6. התבונן בתרבית תאי חיידקים עד שהם מתחילים לזרוח (בערך 1 - 6 שעות).
   הערה: בהתאם למטרת הביטוי, התאים גדלים עד למחרת ואז נקצרים, או שאפשר להמשיך לרעוד כל עוד הם מבריקים. קצירת התאים וטיהור כל החלבונים יכולים להיעשות על פי נהלים סטנדרטיים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
שייקר חממה סטנדרטי Multitron	Infors AG