ניתוח מיקרוסקופי של גידול חיידקים תחת לחץ באמצעות תאים מיקרופלואידיים

תקציר

מקור: Cayron, J., et al. ניתוח רב-ממדי של צמיחת חיידקים תחת טיפולי לחץ. J. Vis. Exp. (2019).

סרטון זה מדגים כיצד להכין ולהשתמש בצלחת מיקרופלואידית להדמיית תאי חיידקים בתנאי עקה. הוא מתאר את תהליך החדרת תרבית חיידקים ומדיום אנטיביוטי מעורר מתח, ואחריו העמסת תאים והתקנה מיקרוסקופית. לאחר מכן משתמשים בהדמיית זמן-lapse במצב ניגודיות פאזה כדי לצפות בהתפתחות של תאים מוארכים וחוטיים עם תכולת DNA מוגברת עקב חלוקת תאים מעוכבת.

פרוטוקול

1. מיקרופלואידיקה הדמיית מיקרוסקופיה בהילוך מהיר
   1. הסר את תמיסת השימור מהצלחת המיקרופלואידית והחלף אותה במדיום טרי שחומם מראש ל-37 מעלות צלזיוס, כמתואר במדריך למשתמש של התוכנה המיקרופלואידית.
   2. אטום את הצלחת המיקרופלואידית למערכת הסעפת ולחץ על כפתור ההתחלה.
   3. הנח את הצלחת המיקרופלואידית עם מערכת הסעפת על המיקרוסקופ stage וחמם מראש ב-37 מעלות צלזיוס למשך ~2 שעות לפני תחילת רכישת המיקרוסקופיה.
      הערה: שלב חימום מוקדם זה הוא קריטי כדי למנוע התרחבות של תא המיקרופלואידי, מה שישנה את מיקוד המיקרוסקופ במהלך ניסוי ה-time-lapse ויפגע ברכישת התמונה.
   4. אטום את הצלחת המיקרופלואידית. החלף את המדיום מבאר 8 ב-150 מיקרוליטר של דגימת תרבית והחלף את המדיום מבאר 1 עד 5 במדיום הרצוי עם או בלי המגיב מעורר הלחץ.
   5. אטום את הצלחת המיקרופלואידית והנח אותה על שלב המיקרוסקופ.
   6. בתוכנה המיקרופלואידית הפעל את הליך טעינת התאים. בדוק שהעמסת התאים משביעת רצון על ידי התבוננות מתחת למיקרוסקופ באור המועבר. הפעל את הליך טעינת התאים בפעם השנייה אם צפיפות התאים בתא אינה מספקת.
   7. בצע מיקוד זהיר במצב אור מועבר ובחר מספר שדות ראייה המציגים חיידקים מבודדים. חשוב לבחור שדות שאינם צפופים מדי כדי שיוכלו לעקוב אחר צמיחת תאים מבודדים לאורך זמן (מומלץ ~10-20 תאים ל-100 מיקרומטר). זה גם יקל על זיהוי תאים במהלך ניתוח תמונה.
   8. בתוכנה המיקרופלואידית, לחץ על כפתור צור פרוטוקול. תכנת את הזרקת מצע הגידול ל-1-2 זמן דור שווה ערך כדי לאפשר לתאים להסתגל (אופציונלי). לאחר מכן תכנת את הזרקת המדיום מעורר הלחץ במשך 10 דקות ב-2 psi, ולאחר מכן הזרקה ב-1 psi למשך הזמן הרצוי של טיפול הלחץ. אם בכוונתך לנתח את התאוששות התאים לאחר לחץ, תכנת את הזרקת מדיום הגידול הטרי למשך הזמן הרצוי.
      הערה: בניסוי המוצג כאן, צפלקסין הוזרק למשך 10 דקות ב-2 psi, ולאחר מכן 50 דקות ב-1 psi. לאחר מכן, מדיום גידול טרי הוזרק ב-2 psi למשך 10 דקות, ואחריו 3 שעות ב-1 psi.
   9. בצע הדמיית מיקרוסקופיה במצב זמן-lapse עם מסגרת אחת כל 10 דקות באמצעות ניגודיות פאזה באור משודר ומקור אור עירור של 560 ננומטר עבור אות mCherry במידת הצורך.
      הערה: חשוב להתחיל ברכישת תמונה מיקרוסקופית במקביל לתחילת פרוטוקול ההזרקה המיקרופלואידית.

חומרים