הערכת נחילי חיידקים באמצעות לוחית מעכב שיפוע

תקציר

מקור: Guo, S., et al. כימות תנועתיות נחיל פני השטח של חיידקים על לוחות שיפוע משרה. J. Vis. Exp. (2022).

סרטון זה מדגים את השימוש בצלחת נחיל שיפוע דו-שכבתית כדי לחקור התנהגות נחיל חיידקים בריכוזי מעכבים משתנים. צלחת עם מעכב יוצר שיפוע בשכבה התחתונה מחוסנת בחיידקים ומודגרת. התמונות מצולמות במרווחי זמן קבועים כדי לנתח את השפעת ריכוז המעכבים על נחיל חיידקים.

פרוטוקול

1. הכנת צלחות נחיל שיפוע

1. הכנת מדיום נחיל
   הערה: ריכוז אגר של 0.7% (w/v) של מדיום נחיל שימש בפרוטוקול זה.
   1. הכינו אבקת מרק ליזוגני (LB) עם אגר בשתי צלוחיות חרוטיות; כל בקבוק מכיל 2 גרם טריפטון, 2 גרם נתרן כלורי (NaCl), 1 גרם תמצית שמרים ו -1.4 גרם אגר. מוסיפים מים מזוקקים כפולים (ddH₂O) ומערבבים את התרחיף בעזרת מוט ערבוב מגנטי. התאם את עוצמת הקול הסופית ל-200 מ"ל על ידי הוספת ddH₂O נוסף.
   2. חיטוי התמיסה ב-121 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. השתמש במכסה חדיר אוויר או בסרט איטום בקבוקים עם פתח אוורור.
      הערה: אגר יתמוסס כאשר הוא מחומם בחיטוי.
   3. כאשר הטמפרטורה יורדת ל-65 מעלות צלזיוס, מערבבים את התמיסה כדי להבטיח הומוגניות, ומעבירים את המדיום לחממה או אמבט מים של 65 מעלות צלזיוס לשימוש קצר טווח.
2. הכנת מדיום נחיל בשכבה התחתונה
   הערה: המדיום בשכבה התחתונה הוא התערובת של מדיום נחיל ופתרונות מלאי משרה. הניסוח של לוחות נחיל שיפוע משרה מוצג בטבלה 1.
   1. הכינו תמיסת מלאי רזברטרול של 100 מ"מ על ידי המסת 114.12 מ"ג של אבקת רסברטרול ליופיל לתוך 5 מ"ל של דימתיל סולפוקסיד (DMSO), ואחסנו את התמיסה בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
   2. הכן תמיסת מלאי ארבינוז של 20% (w/v) על ידי המסת 6 גרם אבקת ארבינוז ב-30 מ"ל של ddH₂O; המתן 10-15 דקות כדי לאפשר לארבינוז להתמוסס; ואחסן את התמיסה בטמפרטורת החדר.
   3. הוציאו את המדיום מהחממה של 65 מעלות צלזיוס והניחו אותו בטמפרטורת החדר; הניחו למדיום הנחיל להתקרר עד שבקבוק ארלנמאייר קריר מספיק כדי להחזיק (~50 מעלות צלזיוס). אל תניח את מדיום הנחיל בטמפרטורת החדר לתקופות ארוכות, מכיוון שהדבר יגרום להתמצקות האגר.
   4. הוסף את הנפח הנדרש של תמיסת מלאי המשרה למדיום הנחיל ב-50 מעלות צלזיוס (טבלה 1). השתמש בפיפטה כדי להוציא את תמיסת המשרה במקום לשפוך אותה. מערבבים בעדינות כדי לערבב את המשרה עם מדיום הנחיל.
      הערה: שלב זה מיועד למשרים שלא ניתן לבצע חיטוי. היזהר לא להכניס בועות למדיום.
3. הכנת צלחות נחיל שיפוע דו-שכבתיות
   הערה: המדיום בשכבה העליונה הוא מדיום LB המכיל 0.7% (w/v) אגר.
   1. סמנו צלחות פטרי מרובעות בגודל 13X13 ס"מ עם שם המשרה והזנים, והניחו את הכלים מעל קצה המכסים (איור 1B).
   2. הוסף 40 מ"ל שכבה תחתונה בינונית חמה (50 מעלות צלזיוס) באמצעות פיפטה של 50 מ"ל או צינור צנטריפוגה של 50 מ"ל.
      הערה: לחלופין, עבור צלחות פטרי מרובעות בגודל 13X13 ס"מ, מתאים 40 מ"ל שכבה תחתונה ושכבה עליונה בינונית; לכלי פטרי מרובעים בגודל 10X10 ס"מ מתאימים שכבה תחתונה של 25 מ"ל ובינונית בשכבה העליונה.
   3. אפשר למדיום השכבה התחתונה להתרפא ללא כיסוי למשך שעה אחת בתוך מכסה זרימה למינרית. אל תפריע לצלחות הפטרי המרובעות בזמן שהמדיום מתמצק.
      הערה: בזמן ריפוי השכבה התחתונה, יש לשמור על מדיום הנחיל שאינו מכיל משרים בחממה או באמבט מים של 65 מעלות צלזיוס.
   4. לאחר שהשכבה התחתונה מתמצקת לחלוטין, הסר את המכסים והניח את צלחות הפטרי המרובעות בתוך קולט אדים למינארי.
   5. הוסף 40 מ"ל של שכבה עליונה חמה בינונית (50 מעלות צלזיוס) באמצעות פיפטה של 50 מ"ל או צינור צנטריפוגה של 50 מ"ל.
      הערה: המדיום בשכבה העליונה אינו מכיל משרים.
   6. רפאו את הצלחות הדו-שכבתיות על הספסל, מכוסות וללא הפרעה למשך שעה. אחסן את הצלחות המוכנות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד 24 שעות.הערה: זמני ריפוי ארוכים יותר יפחיתו את תכולת הלחות ויגבילו את תנועתיות הנחיל.

2. צמיחה של E. coli K12 ו- P. aeruginosa PAO1

1. הכינו 500 מ"ל של מדיום LB על ידי הוספת 5 גרם טריפטון, 5 גרם NaCl ו-2.5 גרם תמצית שמרים ל-ddH₂O, ומלאו את התמיסה ל-500 מ"ל. חיטוי התמיסה על מחזור הנוזל למשך 20 דקות ב-121 מעלות צלזיוס, ואחסן אותה ב-4 מעלות צלזיוס.
2. הכינו 100 מ"ל של 1.5% (w/v) מדיום LB-אגר על ידי הוספת 1 גרם טריפטון, 1 גרם NaCl, 0.5 גרם תמצית שמרים ו-1.5 גרם אגר ל-ddH₂O ומלאו את התמיסה ל-100 מ"ל. חיטוי התמיסה במחזור נוזל למשך 20 דקות ב-121 מעלות צלזיוס. העבירו את המדיום לאמבט מים של 50 מעלות צלזיוס כדי למנוע מהאגר להתמצק.
3. כאשר הבקבוק הבינוני LB-agar נוח לאחיזה, הוסף 20 מ"ל של מדיום LB-agar לצלחת פטרי (בקוטר 10 ס"מ) באמצעות פיפטה של 25 מ"ל. השאירו את הצלחת בטמפרטורת החדר למשך הלילה, ואחסנו את צלחת ה-LB-agar ב-4 מעלות צלזיוס.
4. קח תרביות מלאי המאוחסנות ב-80 מעלות צלזיוס, פס זני E. coli K12, E. coli K12-YdeH, P. aeruginosa PAO1 ו-P. aeruginosa PAO1-YdeH על צלחות פטרי LB-agar באמצעות לולאות חיסון חד פעמיות. מדגרים את צלחות הפטרי הפוכות למשך הלילה בחום של 37 מעלות צלזיוס.
5. בחרו מושבות בודדות לזנים שונים מצלחות הפטרי, חסנו כל מושבה ל-5 מ"ל של מדיום LB, ודגרו על התרבית ב-37 מעלות צלזיוס בשייקר אורביטלי מעבדתי המוגדר ב-220 סל"ד.
6. כאשר צפיפות התרבות מגיעה ל-OD600nm ~ 1.0, הסר את התרבות מהשייקר והנח אותה בטמפרטורת החדר. התאם את צפיפות התרבות ל-OD600nm = 1.0, כמתואר בשלב 3.2.1.

3. חיסון ודגירה של צלחות נחיל שיפוע

1. הכנת בארות חיסון
   הערה: ניתן להשתמש במודלים של כיסוי הדפסת תלת מימד המסוגלים לייצר בארות המופרדות במרחק סטנדרטי במקום בשיטה המתוארת להלן.
   1. סמן את מיקומי הבאר על נייר A4, כפי שמוצג באיור 1C. הגדר שלושה ריכוזי בדיקה בצלחת פטרי מרובעת אחת עם שניים או שלושה שכפולים.
   2. הנח את נייר ה-A4 המסומן מתחת לצלחת שיפוע מוצקה. דחוף את הצד הרחב יותר של קצה פיפטה של 100 מיקרוליטר לתוך המשטח הבינוני המוצק למחצה במיקום המסומן. לחץ על קצה הפיפטה עד שהוא מגיע לתחתית המדיום של השכבה העליונה.
   3. כאשר הקצה נוגע בתחתית, אל תפעיל כוח אנכי על הקצה; סובב בעדינות את הקצה כדי לבודד את תכולת הבאר הגלילית.
   4. הזיזו אופקית את קצות הפיפטות לאורך מרחק קטן מאוד כדי לאפשר זרימת אוויר לתוך החלל הצר שהונח בצד. לחץ על הקצה עם האצבע המורה כדי לחסום את זרימת הגז בתוך הקצה תוך החזקת הפיפטה באמצעות האגודל והאצבע האמצעית.
   5. משוך את הקצה החוצה אנכית, תוך שמירה על תכולת הבאר בקצה תוך כדי משיכתו החוצה.
      הערה: אם תכולת הבאר מחליקה, הפעל מעט יותר לחץ עם האצבע המורה כדי לאטום את הקצה לחלוטין.
   6. חזור על שלבים 3.1.2 עד 3.1.5 בכל מיקום מסומן. מכסים את צלחת הנחיל לפני החיסון.
2. חיסון ודגירה של צלחת שיפוע
   1. התאם את צפיפות תרבית הגידול בן לילה ל-OD600nm = 1.0.
   2. פיפטה 80 מיקרוליטר של תרבית גידול הלילה לכל באר. אין לשפוך את תרבית החיידקים מחוץ לבארות.
   3. עטפו את הצלחות בסרט איטום. לתצפית ארוכת טווח (3-5 ימים), עטפו את הצלחות בסרט גומי מעבדה סטרילי.
      הערה: סרט גומי נוטה פחות להישבר.
   4. הנח מלאה ב-ddH₂O בחממה כדי לשמור על לחות בתוך החממה. דגרו את צלחות נחיל השיפוע בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
      הערה: אין לדגור את צלחות הנחיל הפוכות; זה יגרום לתרבית החיידקים לדלוף מהבארות.
   5. דמיין את צלחת הנחיל מיד לאחר החיסון, ורשום זאת כנקודת הזמן של 0 שעות.

4. הדמיית נחיל חיידקים על פני השטח

1. הוציאו את צלחות הנחיל, אחת בכל פעם, מהחממה כל 12 שעות, החזיקו את הצלחת בצורה אופקית, והניחו אותן במערכת הדמיית הג'ל (ראו טבלת החומרים).
   הערה: אל תשאיר טביעות אצבע על פני הלוחות; החזק את הצד של צלחת הנחיל בכפפות נקיות.
2. בחר מצב הדמיית ג'ל ; לחשוף את צלחת הנחיל לאור לבן; והתאם את אורך המוקד כדי לתת את התצוגה הברורה ביותר של נחילים.
   הערה: השתמש באותו אורך מוקד עבור כל הלוחות באצווה נתונה.
3. שפר את בהירות הנחילים לתצפית ברורה על ידי התאמת זמן החשיפה ל-300 אלפיות השנייה. כוונן את הסף כדי למזער הפרעות מתאורת הרקע.
   הערה: הסף מותאם בממשק ההפעלה של מערכת הדמיית הג'ל. הגדל את הערכים בצד שמאל כדי למזער הפרעות מאור רקע; הפחת ערכים בצד ימין כדי לשפר את בהירות הנחילים. בפרוטוקול זה, האזור הוא בדרך כלל בין 6,000 ל-50,000.
4. שמור את קובץ התמונה להמשך ניתוח. רשום את זמן ההדמיה, סוג המשרה, כיוון השיפוע והזנים בקובץ .txt .

 

טבלה 1: מפרט בינוני של נחיל דו-שכבתי.

שכבה עליונה בינונית/ליזוגנית בינונית (ל-100 מ"ל)
טריפטון: 1 גרם
נתרן כלורי: 1 גרם
תמצית שמרים: 0.5 גרם
אגר: 0.7 גרם
מדיום שכבה תחתונה/מדיום המכיל משרה (לכל 100 מ"ל)
טריפטון: 1 גרם	ריכוז עבודה:	ריכוז תמיסת מלאי:
נתרן כלורי: 1 גרם
תמצית שמרים: 0.5 גרם	- רזברטרול: 400 מיקרומטר	- רזברטרול: 100 מ"מ
אגר: 0.7 גרם
משרה:	- ארבינוז: 0.5% (w/v)	- ארבינוז: 20% (w/v)
- תמיסת מלאי רזברטרול: 400 מיקרוליטר	או 1% (w/v)
- תמיסת מלאי ארבינוז: 2.5 מ"ל או 5 מ"ל

תוצאות

איור 1: סכמטי של הכנת צלחת נחיל שיפוע משרה הכנה, חיסון ודגירה. (A) גידול לילה של תרבית חיידקים ב-37 מעלות צלזיוס. (B) זרימת עבודה של צלחת נחיל שיפוע משרה דו-שכבתית. א) תמכו בצלחות פטרי מרובעות. ii) יוצקים את המדיום בשכבה התחתונה ומתמצקים בטמ...

חומרים