זיהוי קולורימטרי של פירוק קליפת המוח במהלך נביטת נבגי חיידקים

תקציר

מקור: Francis, M. B., et al. איתור שברי קליפת המוח במהלך נביטת נבגי חיידקים. J. Vis. Exp. (2016).

סרטון זה מדגים שיטה קולורימטרית לאיתור פירוק קליפת המוח במהלך נביטת נבגי חיידקים על ידי מדידת שחרור סוכרים מפחיתים לאורך זמן. באמצעות תקני N-אצטיל גלוקוזאמין ודגימות נקודת זמן, הבדיקה מכמתת את ריכוז הסוכר באמצעות תגובה כרומוגנית סגולה, המציינת את היקף ההידרוליזה של קליפת המוח.

פרוטוקול

1. מגיב צבע

1. בזמן שהדגימות נמצאות על קרח, הכינו את מגיב הצבע. ממיסים 0.320 גרם p-dimethylaminobenzaldehyde (DMAB; המגיב של ארליך) ב-1.9 מ"ל של חומצה אצטית קרחונית
   הערה: המגיב רגיש לזמן, לטמפרטורה ולאור ואין להכין אותו מראש.
2. לאחר שה-DMAB מתמוסס לחלוטין, הוסף 100 מיקרוליטר של 10 N HCl ומערבולת.
3. הוסף 5 מ"ל חומצה אצטית קרחונית ומערבולת.

2. תגובה קולורימטרית

1. העבירו 100 מיקרוליטר מכל דגימת קליפת המוח שהתקררה לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש של 1.5 מ"ל.
2. הוסף 700 מיקרוליטר מתמיסת הצבע שהוכנה טרי לכל דגימה.
3. העבירו מיד את הדגימות לאמבט מים של 37 מעלות צלזיוס ודגרו למשך 20 דקות בדיוק.
4. מעבירים 200 מיקרוליטר מכל דגימה לצלחת ברורה של 96 בארות.
5. כמת את הדגימות ב-585 ננומטר בקורא צלחות. הדגימות צריכות להתחיל בצבע צהוב ותגובה חיובית תעבור לסגול. ככל שקליפת המוח נוכחת יותר, כך הצבע הסגול עמוק יותר.

חומרים