ייצור חלבון רקומביננטי והתאוששות משלפוחיות שמקורן בחיידקים

תקציר

מקור: Streather, B. R., et al. ייצור וניתוח אופטימלי של שלפוחיות מלאות חלבון רקומביננטיות מ- E. coli. J. Vis. Exp. (2023)

סרטון זה מדגים את הייצור והבידוד של חלבונים רקומביננטיים המתויגים עם פפטיד גרעין שלפוחית (VNp) משלפוחיות חיידקים. משרה מפעיל ביטוי חלבון מתויג VNp, מניע היווצרות שלפוחית ואנקפסולציה, ואחריו צנטריפוגה וסוניקציה לשחזור חלבון יעיל ללא ליזה תאית

פרוטוקול

1. תרבית תאי חיידקים והשראת חלבון

1. כדי לגרום לביטוי חלבון רקומביננטי ממקדם T7, הוסף איזופרופיל β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) לריכוז סופי של עד 20 מיקרוגרם/מ"ל (84 מיקרומטר). השראת ביטוי חלבון רקומביננטי חייבת להתרחש בשלב ה-log-log המאוחר (כלומר, צפיפות אופטית טיפוסית, OD₆₀₀ של 0.8-1.0) לייצור שלפוחית. ​
   הערה: אורך תקופת האינדוקציה עשוי להיות שונה בין החלבונים, כאשר חלקם מגיעים לייצור מקסימלי תוך 4 שעות ואחרים בן לילה (18 שעות). עד כה, ייצוא שלפוחית מקסימלי הושג בתרביות לילה.

2. בידוד שלפוחית רקומביננטי

1. גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה בטמפרטורה של 3,000 x גרם (4 מעלות צלזיוס) למשך 20 דקות.
2. כדי לעקר מדיה המכילה שלפוחית לאחסון לטווח ארוך, העבירו את מצע התרבית המנוקה דרך מסנן פוליאתרסולפון (PES) סטרילי ונטול חומרי ניקוי של 0.45 מיקרומטר.
   הערה: כדי לבדוק את אי הכללתם של תאים ברי קיימא מהפילטר המכיל שלפוחית, יש להניח צלחת על אגר מרק ליזוגני (LB) ולדגור למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
3. כדי לרכז שלפוחיות לנפח קטן יותר, העבירו את החומר הסטרילי המכיל שלפוחית דרך מסנן אסטרי תאית מעורבים (MCE) סטרילי ונטול חומרי ניקוי של 0.1 מיקרומטר.
4. שטפו בעדינות את הממברנה עם 0.5-1 מ"ל של מי מלח סטריליים עם חוצץ פוספט (PBS) באמצעות מגרד תאים או מפזר פלסטיק כדי להסיר בזהירות שלפוחיות מהממברנה. מעבירים לצינור מיקרופוגה טרי. ​
   הערה: ניתן לאחסן שלפוחיות מטוהרות במדיה סטרילית או PBS בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. ישנן דוגמאות לחלבונים רקומביננטיים המאוחסנים בשלפוחיות אלה במשך 6 חודשים, באופן זה, ללא אובדן פעילות אנזימטית.

3. שחרור חלבון מסיס משלפוחיות מבודדות

1. לאחר שבודדו שלפוחיות המכילות חלבון למדיה/מאגר הסטרילי, הכניסו את ממברנות השומנים השלפוחיתיות לסוניקציה באמצעות לוח זמנים מתאים למנגנון (למשל, מחזורי הפעלה וכיבוי של 6x 20 שניות) וצנטריפוגה ב-39,000 x גרם (4 מעלות צלזיוס) למשך 20 דקות להסרת פסולת שלפוחית. הערה: הלם אוסמוטי או טיפול בחומרי ניקוי יכולים לשמש כחלופה לפתיחת השלפוחית, אך יש לקחת בחשבון את ההשפעה על תפקוד החלבון ו/או היישום במורד הזרם.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
איזופרופיל β-D-1-תיוגלקטופירנוזיד (IPTG)	מלפורד	367-93-1
מרק ליזוגני (LB) / אגר LB	מלאי מעבדה	נה	10 גרם/ליטר טריפטון; 10 גרם/ליטר NaCl; 5 גרם/ליטר תמצית שמרים (1.5 גרם/ליטר אגר)
מסנן ממברנה MF-Millipore (0.1 מיקרומטר, MCE)	מרק	VCWP04700
מסנן ממברנה Millipore Express PLUS (0.45 מיקרומטר, PES)	מרק	HPWP04700
תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS)	מלאי מעבדה	נה