העברת פלסמיד F ובחירת אנטיביוטיקה כפולה ב- E. coli

תקציר

מקור: Erdogan, F., et al., מבחני הזדווגות מצומדים לניתוח ספציפי לרצף של חלבוני העברה המעורבים בצימוד חיידקים. J. Vis. Exp. (2017)

סרטון זה מדגים את ההליך להעברת פלסמיד F מתאי E. coli מתורם לנמען באמצעות פלסמיד הצלה ובחירת טרנסקונג'וגנטים באמצעות עמידות כפולה לאנטיביוטיקה. התהליך כולל ערבוב תרביות חיידקים, דגירה ללא טלטול, שיבוש זוגות הזדווגות וציפוי על מדיה סלקטיבית כדי לאשר העברת פלסמיד מוצלחת.

פרוטוקול

1. בדיקת הזדווגות מצומדת מתורמי XK1200 למקבלי MC4100

1. הכן תרבית O/N של תאי XK1200 pOX38-Tc Δgene::Cm + pK184-gene ב-20 מ"ל של מרק ליזוגני סטרילי (LB) עם 20 מיקרוגרם/מ"ל כלורמפניקול (Cm), 50 מיקרוגרם/מ"ל קנמיצין (Km) ותאי MC4100 ב-5 מ"ל LB עם 50 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין (Sm) באמצעות תאים ממאגר גליצרול או מושבה בודדת על צלחת אגר ופיפטה או לולאה סטרילית. לגדל תרביות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם טלטול של 200 סל"ד.
2. בצע דילול של 1:70 מכל תרבית O/N בנפרד ב-2 מ"ל של LB סטרילי עם אותה אנטיביוטיקה. הוסף גלוקוז לריכוז סופי של 100 מ"מ לכל התאים התורמים. גידול תאים לשלב אמצע העץ (OD₆₀₀ 0.5-0.7) ב-37 מעלות צלזיוס עם טלטול ב-200 סל"ד.
3. צנטריפוגה (4,000 x גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס) לתאי גלולה, להשליך סופרנטנט, לשטוף פעם אחת עם LB סטרילי קר כדי להסיר אנטיביוטיקה, ולהשעות תאים ב-2 מ"ל LB סטרילי קר.
4. בשכפול, יש להקצות 100 מיקרוליטר מכל תרבית ל-800 מיקרוליטר של מדיה סטרילית LB ולאפשר להם להזדווג ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת מבלי לרעוד.
5. מערבל את התאים למשך 30 שניות כדי לשבש את זוגות ההזדווגות והניח אותם על קרח למשך 10 דקות כדי למנוע הזדווגות נוספת.
6. בעזרת התערובת המערבולת ו- LB סטרילי טרי, הכינו 6 דילולים (^10-2 עד ^10-7) של הטרנסקונג'וגנטים. בחר עבור תאי MC4100 pOX38-Tc Δgene::Cm הטרנס-מצומדים על ידי איתור 10 מיקרוליטר של כל דילול על כל מחצית של לוחות אגר המכילים 50 מיקרוגרם/מ"ל Sm ו-20 מיקרוגרם/מ"ל ס"מ, כמו באיור 1. חזור על הפעולה עבור שתי התערובות הכפולות. שמור על האזור סטרילי ועבוד ליד להבה. דגירה של צלחות O/N ב-37 מעלות צלזיוס.

תוצאות

איור 1: בדיקת הזדווגות להערכת תפקוד גן המטרה בצימוד. תאי התורם והנמען היו E. coli XK1200 pOX38-Tc ΔtraF::Cm שעבר טרנספורמציה עם pK184-TraF ו-MC4100, בהתאמה. הטרנסקונג'וגנטים המתקבלים (MC4100 pOX38-Tc ΔtraF

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
צלחות פטרי	פישר סיינטיפיק	FB0875713
אנטיביוטיקה			ריכוזים סופיים
כלורמפניקול (ס"מ)	פישר סיינטיפיק	BP904-100	20 מיקרוגרם/מ"ל
קנאמיצין (ק"מ)	ביובייסיק בע"מ	DB0286	50 מיקרוגרם/מ"ל
סטרפטומיצין (Sm)	פישר סיינטיפיק	BP910-50	50 מיקרוגרם/מ"ל