נטרול חיידקים באמצעות פלבין מונונוקלאוטיד המופעל באור

תקציר

מקור: Cheng, C., et al. השבתת פתוגנים באמצעות פוטוליזה באור נראה של ריבופלבין-5'-פוספט. J. Vis. Exp. (2022)

סרטון זה מדגים שיטה להערכת ההשפעות הפוטוטוקסיות של פלבין מונונוקלאוטיד (FMN) על חיידקים פתוגניים. תרביות חיידקים חשופות לריכוזים הולכים וגדלים של FMN ומוארות באור נראה כדי ליצור מיני חמצן תגובתיים (ROS) הפוגעים ברכיבים תאיים. לאחר מכן מכמתים את החיידקים השורדים כדי להעריך את הירידה תלוית המינון בכדאיות.

פרוטוקול

1. כדאיות Staphylococcus aureus (S. aureus) לאחר פוטוליזה של FMN (איור 1)
   1. העבירו מושבה של S. aureus (BCRC 10451) מצלחת מתורבתת לתוך 10 מ"ל של מרק ליזוגני שנלקח במבחנה עם מכסה בורג של 15 מ"ל. תרבית בשייקר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות.
   2. העבירו 0.5 מ"ל מהתרבית לצינור צנטריפוגה של 1.5 מ"ל. הוסף מים מעוקרים לתוך צינור הצנטריפוגה כדי לדלל את התרבית לצפיפות אופטית של 0.5 ב-600 ננומטר (OD₆₀₀) (~6 x 10⁷ יחידה יוצרת מושבה [CFU]/מ"ל).
   3. העבירו 0.5 מ"ל מהתרבית לצינור צנטריפוגה של 1.5 מ"ל, צנטריפוגה ב-14,000 x גרם למשך 10 דקות, ושפכו את הסופרנטנט כדי לקבל כדור תא.
   4. הוסף 1 מ"ל של ריבופלבין-5'-פוספט (או פלבין מונונוקלאוטיד; FMN) תמיסה חוצצת (30, 60 ו-120 מיקרומטר FMN במאגר אשלגן פוספט [PB]) לכדורי התא המתקבלים כמו בשלב 1.3, ומערבולת. לשליטה מוקרנת, הוסף 1 מ"ל PB בלבד.
   5. העבירו 1 מ"ל כל אחד מתמיסות תאי חיידקים ברות קיימא המכילות 30 מיקרומטר FMN ו-PB בלבד לתוך צינורות זכוכית, והקרינו אותם באור סגול ב-10 W/m² למשך 30 דקות.
   6. העבירו 1 מ"ל כל אחד מתמיסות תאי חיידקים ברות קיימא המכילות 30, 60 ו-120 מיקרומטר FMN ו-PB בלבד לתוך צינורות זכוכית והקרינו אותם באור כחול ב-20 W/m² למשך 120 דקות. הקימו צינור זכוכית נוסף עם 1 מ"ל של תמיסת תאי חיידקים בת קיימא המכילה 120 מיקרומטר FMN והקרינו אותו באור כחול ב-20 W/m² למשך 60 דקות.
   7. הגדר מבחנות כמתואר בשלבים 1.5 ו-1.6 וכסה אותן בנייר אלומיניום עבה. צינורות אלה משמשים כפקדים אפלים.
   8. שמור את תא ההקרנה (כמו גם את בקרות החושך) בחדר קר בטמפרטורה של 9 ± 1 מעלות צלזיוס במהלך תקופת ההקרנה של 30-120 דקות.
      הערה: לא ניתן להתעלם מחום המשתחרר על ידי נורות דיודה פולטות אור (LED), מכיוון ששבבי ה-LED המונחים בתוך הכוס יכולים לחמם את מערכת הפוטו-ריאקציה במהלך ניסויי הקרנה. הניסויים נערכו, אם כן, בחדר קירור שנשמר בטמפרטורה של 9 ± 1 מעלות צלזיוס.
   9. לאחר ההקרנה, העבירו 0.2 מ"ל מכל אחת מתמיסות התגובה לצלחת אגר לוריא (LA). מורחים את החיידקים על הצלחת בעזרת מוט זכוכית בצורת L ודוגרים למשך הלילה בחום של 37 מעלות צלזיוס.
   10. חשב את ספירת הלוחות הקיימא ואת שיעורי ההשבתה של S. aureus לאחר צמיחה בן לילה.

הערה: שיעור ההשבתה של S. aureus מחושב כאחוז ההפחתה, השווה ל-[1 -I / D] ×100%, כאשר I ו-D מציינים בהתאמה את מספר ה-CFUs בדגימה המוקרנת ובבקרה החשוכה. אחוז ההפחתה מוגדר כערך שלילי של שיעור ההשבתה.

תוצאות

איור 1: השפעת פוטוליזה של FMN על כדאיות S. aureus.אחוז ההפחתה מוגדר כערך שלילי של קצב ההשבתה עבור S. aureus שטופל ב-(A) FMN תחת קרינת אור כחול ב-20 W/m² למשך 120 דקות ו-(<...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
נורות LED כחולות, ירוקות ואדומות	Vita LED טכנולוגיות ושות', טיינאן, טייוואן		DC 12 V 5050
דימתיל סולפוקסיד	סיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, מיזורי	190186
מדחום אינפרא אדום	Raytek Co. סנטה קרוז, קליפורניה	MT4
מרק LB	Difco Co., ניו ג'רזי
ל-מתיונין	סיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, מיזורי	1.05707
NBT	Bio Basic, Inc. מרקהם, אונטריו, קנדה
ספק כוח	China tech Co., טאיפיי סיטי החדשה, טייוואן	י.פ30-3-2
ריבופלבין 5′-פוספט	סיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, מיזורי	₪1774
RNase	ניו אינגלנד BioLabs, Inc. איפסוויץ', מסצ'וסטס
מד כוח סולארי	Tenmars Electronics Co., טאיפיי, טייוואן	TM-207
Staphylococcus aureus subsp. aureus	המרכז לאיסוף ומחקר משאבים ביולוגיים (BCRC), שינג'ו, טייוואן	10451
ספקטרומטר אופטי UV-Vis	אופטיקה אוקיינוס, דנידין, פלורידה	USB4000
ספקטרופוטומטר UV-Vis	תאגיד היטאצ'י היי-טק למדע, טוקיו, יפן	U-2900
לד סגול	Long-hui אלקטרונית ושות', בע"מ, דונגגוואן, סין