כימות של השבתה חיידקית הנגרמת על ידי אור באמצעות יצירת מיני חמצן תגובתיים

תקציר

מקור: Cheng, C., et al. השבתת פתוגנים באמצעות פוטוליזה באור נראה של ריבופלבין-5'-פוספט. J. Vis. Exp. (2022).

בסרטון זה, תערובת תגובה חוצצת המכילה L-מתיונין, טטרזוליום כחול ניטרו (NBT) ופלבין מונונוקלאוטיד (FMN) מוקרנת באור סגול כדי לגרום לייצור מיני חמצן תגובתיים (ROS). זה מוביל להשבתת חיידקים ולהיווצרות פורמזאן הניתן לזיהוי ספקטרומטרי.

פרוטוקול

1. איתור מיני חמצן תגובתיים (O₂•⁻) בסטפילוקוקוס זהוב

1. הכן את דגימות הסטפילוקוקוס אוראוס .
2. לדלל את צפיפות החיידקים של הדגימות במים מעוקרים לצפיפות אופטית של 0.5 ב-600 ננומטר (OD (צפיפות אופטית)₆₀₀, ~6 x 10⁶ CFU (יחידה יוצרת מושבה) /מ"ל). העבירו 0.5 מ"ל מהתרבית לצינור צנטריפוגה של 1.5 מ"ל. צנטריפוגה ב-14,000 x גרם למשך 10 דקות ושפכו את הסופרנטנט לקבלת כדור תא.
3. הוסף 0.1093 גרם L-מתיונין, 0.1 גרם NBT (ניטרו כחול טטרזוליום כלוריד) ו-25 מ"ל FMN (פלבין מונונוקלאוטיד) (400, 240 או 120 מיקרומטר) ל-75 מ"ל PB (מאגר פוספט). עבור כל 1 מ"ל של המגיב המופעל, הריכוזים הסופיים של FMN, מתיונין ו-NBT הם 100 (60 או 30) ^×-10-6 M, 7.3 ×-10-3 M, ^ו-1.2 ×-^10-3 M, בהתאמה.
4. הוסף 1 מ"ל מכל תמיסת מגיב (כלומר, עם ריכוזי FMN משתנים) לכדורי התא המתקבלים. הקרינו את התמיסות באור סגול ב-10 W/m² למשך 10 דקות.
5. צנטריפוגה את התערובת ב-14,000 x גרם למשך 10 דקות ושפכו את הסופרנטנט. השעו מחדש את הגלולה ב-1 מ"ל של דימתיל סולפוקסיד (DMSO) כדי לחלץ את ה-NBT המופחת. זהה את מיני ה-O₂•⁻ המיוצרים מהספיגה ב-560 ננומטר.

חומרים