כימות של השבתה חיידקית הנגרמת על ידי אור באמצעות יצירת מיני חמצן תגובתיים

תקציר

מקור: Cheng, C., et al. השבתת פתוגנים באמצעות פוטוליזה באור נראה של ריבופלבין-5'-פוספט. J. Vis. Exp. (2022).

בסרטון זה, תערובת תגובה חוצצת המכילה L-מתיונין, טטרזוליום כחול ניטרו (NBT) ופלבין מונונוקלאוטיד (FMN) מוקרנת באור סגול כדי לגרום לייצור מיני חמצן תגובתיים (ROS). זה מוביל להשבתת חיידקים ולהיווצרות פורמזאן הניתן לזיהוי ספקטרומטרי.

פרוטוקול

1. איתור מיני חמצן תגובתיים (O₂•⁻) בסטפילוקוקוס זהוב

1. הכן את דגימות הסטפילוקוקוס אוראוס .
2. לדלל את צפיפות החיידקים של הדגימות במים מעוקרים לצפיפות אופטית של 0.5 ב-600 ננומטר (OD (צפיפות אופטית)₆₀₀, ~6 x 10⁶ CFU (יחידה יוצרת מושבה) /מ"ל). העבירו 0.5 מ"ל מהתרבית לצינור צנטריפוגה של 1.5 מ"ל. צנטריפוגה ב-14,000 x גרם למשך 10 דקות ושפכו את הסופרנטנט לקבלת כדור תא.
3. הוסף 0.1093 גרם L-מתיונין, 0.1 גרם NBT (ניטרו כחול טטרזוליום כלוריד) ו-25 מ"ל FMN (פלבין מונונוקלאוטיד) (400, 240 או 120 מיקרומטר) ל-75 מ"ל PB (מאגר פוספט). עבור כל 1 מ"ל של המגיב המופעל, הריכוזים הסופיים של FMN, מתיונין ו-NBT הם 100 (60 או 30) ^×-10-6 M, 7.3 ×-10-3 M, ^ו-1.2 ×-^10-3 M, בהתאמה.
4. הוסף 1 מ"ל מכל תמיסת מגיב (כלומר, עם ריכוזי FMN משתנים) לכדורי התא המתקבלים. הקרינו את התמיסות באור סגול ב-10 W/m² למשך 10 דקות.
5. צנטריפוגה את התערובת ב-14,000 x גרם למשך 10 דקות ושפכו את הסופרנטנט. השעו מחדש את הגלולה ב-1 מ"ל של דימתיל סולפוקסיד (DMSO) כדי לחלץ את ה-NBT המופחת. זהה את מיני ה-O₂•⁻ המיוצרים מהספיגה ב-560 ננומטר.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
דימתיל סולפוקסיד	סיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, מיזורי	190186
מדחום אינפרא אדום	Raytek Co. סנטה קרוז, קליפורניה	MT4
מרק LB	Difco Co., ניו ג'רזי
ל-מתיונין	סיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, מיזורי	1.05707
NBT (ניטרו כחול טטרזוליום כלוריד)	Bio Basic, Inc. מרקהם, אונטריו, קנדה
ספק כוח	China tech Co., טאיפיי סיטי החדשה, טייוואן	י.פ30-3-2
ריבופלבין 5′-פוספט	סיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, מיזורי	₪1774
מד כוח סולארי	Tenmars Electronics Co., טאיפיי, טייוואן	TM-207
Staphylococcus aureus subsp. aureus	המרכז לאיסוף ומחקר משאבים ביולוגיים (BCRC), שינג'ו, טייוואן	10451
ספקטרומטר אופטי UV-Vis	אופטיקה אוקיינוס, דנידין, פלורידה	USB4000
ספקטרופוטומטר UV-Vis	תאגיד היטאצ'י היי-טק למדע, טוקיו, יפן	U-2900
לד סגול	Long-hui אלקטרונית ושות', בע"מ, דונגגוואן, סין