קביעת היעילות האנטיבקטריאלית של רצועה פולימרית עמוסה באנטיביוטיקה

תקציר

מקור: Sekar, A., et. al., שיטה חדשה לקביעת הפעילות האנטיבקטריאלית האורכית של חומרים מסירת תרופות. J. Vis. Exp. (2023)

סרטון זה מדגים בדיקה מבוססת לומינסנציה להערכת היעילות האנטיבקטריאלית של רצועה פולימרית עמוסה באנטיביוטיקה על ידי כימות זוהר מונע ATP, הפוחת בתרביות חיידקים החשופות לאנטיביוטיקה.

פרוטוקול

הגדרת מחקר פעילות אנטיבקטריאלית תלוית זמן

1. תרבית את החיידקים למשך הלילה ב-1 מ"ל של מרק TSB (מרק סויה טריפטי).
2. לדלל את תרחיף החיידקים שגדל בן לילה ל-10⁵ CFU/mL ב-MHB סטרילי (מרק מולר-הינטון), ולוודא את ספירת החיידקים הקיימא באמצעות יחידות הזוהר לפני תחילת הניסוי.
3. הנח את רצועות UHMWPE הבתוליות (פוליאתילן במשקל מולקולרי גבוה במיוחד) ורצועות UHMWPE עמוסות בתרופות (3 מ"מ x 5 מ"מ x 10 מ"מ) בתוך מזרק של 3 מ"ל.
4. משוך MHB המכיל 10⁵ CFU/mL לתוך המזרק דרך המחט המחוברת עד לסימון 1.5 מ"ל, השווה ערך ל-1.35 מ"ל של MHB (איור 1: שלב 1).
5. הנח את מערך המזרק באינקובטור רועד (100 סל"ד) בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עד לנקודות הזמן שצוינו: 6 שעות, יום 1, יום 2, יום 3, יום 4, יום 5, יום 6 ויום 7 (איור 1: שלב 2).
6. בכל נקודת זמן שצוינה, הוציאו את מערך המזרק ובצעו בדיקת כדאיות מיקרוביאלית בזמן אמת על 100 מיקרוליטר של תרחיף חיידקים (איור 1: שלב 3-4).
   1. בצע את הבדיקה המבוססת על זוהר באמצעות לוחות לבנים אטומים עם תחתית 96 בארות.
   2. מערבבים 100 מיקרוליטר של תרחיפי חיידקים מדוללים עם 100 מיקרוליטר של מגיב בדיקה.
   3. מניחים מכסה מכוסה בנייר אלומיניום מעל הצלחת המוכנה של 96 בארות, ודוגרים במשך 5 דקות בנענוע של 100 סל"ד.
   4. מדוד את הזוהר באופן מיידי עם קורא מיקרו-פלטות באמצעות ההגדרות הבאות בתוכנת Gen5 3.11.
      1. לחץ על חדש כדי להגדיר פרוטוקול בחלון מנהל המשימות .
      2. בחר Costar 96 לבן אטום בתפריט הנפתח עבור סוג צלחת.
      3. לחץ על קריאה תחת תפריט בחר שלבים > פעולות .
      4. לחץ על זוהר בחלון שיטת קריאה. השאר את אפשרויות נקודת הקצה/קינטי וסיבי זוהר מסומנות תחת סוג קריאה וסוג אופטיקה, בהתאמה. לחץ על אישור.
      5. שמור את הגדרות <ברירת המחדל> בחלון שלב קריאה (רווח = 135; זמן שילוב = שנייה אחת; גובה קריאה = 4.5 מ"מ). לחץ על אישור.
      6. חלון פריסת הלוחות נראה מוכן להפעלה. סמן את התיבה השתמש במכסה בחלון לוחית העומס ולחץ על אישור.
      7. הנח את צלחת 96 הבארות במכונה כדי לקרוא את ערכי הזוהר.
7. קבע את ספירת החיידקים הקיימא עבור נקודות הזמן של 6 שעות, יום 1, יום 2, יום 3 ויום 7. קבע את ה-CFU (יחידות יוצרות מושבה)/מ"ל מיחידות הזוהר באמצעות העקומה הסטנדרטית המתאימה.
8. ודא את היעדר חיידקים ברי קיימא בדגימות שהראו ערכי זוהר מתחת לגבול הזיהוי על ידי ביצוע שיטת הצלחת המתפשטת על צלחות TSA (אגר סויה טריפטית) ודגירה בטמפרטורה של 35 מעלות צלזיוס למשך הלילה. בדוק אם יש מושבות למחרת.
9. צנטריפוגה את תרחיף החיידקים הנותר ב-10,000 × גרם למשך 10 דקות, ושואב בעדינות את המדיה המושקעת. עבור צינורות שבהם כדורים אינם נצפים ויזואלית עקב הפעילות האנטיבקטריאלית של התרופות, השאירו 100 מיקרוליטר בשפופרת כדי להבטיח שהכדור הבלתי נראה לא יופרע (איור 1: שלב 5).
10. השעו מחדש את החיידקים הגלולים ב-MHB טרי, ומשכו לאחור את תרחיף החיידקים לאותו מערך מזרק דרך המחט המחוברת (איור 1: שלב 6).

תוצאות

איור 1: ייצוג סכמטי של מערך הניסוי.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
ATCC 12600	אוסף תרבות הסוג האמריקאי, וירג'יניה, ארה"ב
בדיקת כדאיות תאים מיקרוביאלית של BacTiter-Glo	Promega Corporation, ארה"ב	G8231
מרק סויה טריפטי BD Bacto (מדיום עיכול פולי סויה-קזאין)	Becton-Dickinson, ארצות הברית	BD 211825	נרכש מפישר סיינטיפיק, ארה"ב
מזרק BD Luer-Lok סטרילי, לשימוש חד פעמי, 3 מ"ל	BD, ארצות הברית	309657
מחט BD 5/8 אינץ'. חד פעמי, סטרילי, 25 גרם	BD, ארצות הברית	305122
BD BBL Dedryated Culture Media: מרק מולר הינטון II (מותאם לקטיונים)	Becton-Dickinson, ארצות הברית	B12322	נרכש מפישר סיינטיפיק, ארה"ב
מדיית תרבית מיובשת BD Difco: אגר סויה טריפטי (אגר עיכול סויה-קזאין)	Becton-Dickinson, ארצות הברית	DF0369-17-6	נרכש מפישר סיינטיפיק, ארה"ב
ג'נטמיצין סולפט	פוג'יאן פוקאנג פרמצבטיקה ושות', פוג'ואו, סין
חממת טלטול ספסל LSE	קורנינג, ניו יורק, ארה"ב
קורא צלחות (Synergy H1	ביוטק, ורמונט, ארה"ב
שייקר אינובה 2100	ניו ברונסוויק סיינטיפיק, ניו ג'רזי, ארה"ב
UHMWPE	GUR1020, סלנז, טקסס, ארה"ב
ונקומיצין הידרוכלוריד	Fagron , הולנד	804148