דפוס מיקרופלואידית ומעקב מבוסס פלואורסצנטי של צמיחת חיידקים חד-תאיים

תקציר

מקור: Pioli, R., et al., דפוס של מיקרואורגניזמים ומיקרו-חלקיקים באמצעות הרכבה בסיוע נימיות רציפה. J. Vis. Exp. (2021)

סרטון זה מדגים את השיטה של לכידת תאי Escherichia coli (E. coli) בודדים מתויגים פלואורסצנטית במלכודות מיקרופלואידיות באמצעות תרחיף נטול פחמן וזרימה מבוקרת, ואחריו תוספת חומרים מזינים כדי לעורר צמיחה והדמיה פלואורסצנטית של מיקרו-מושבות.

פרוטוקול

1. דפוס חיידקים

1. יום אחד לפני הניסוי, גדל אוכלוסייה של Escherichia coli (זן MG1655 prpsM-GFP). חסנו את התרבית ישירות מהמלאי הקפוא וגידלו למשך הלילה במשך 20 שעות במדיום מרק ליזוגני (LB) בחממת שייקר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. הוסיפו 50 מיקרוגרם/מ"ל של קנמיצין כדי שהתאים ישמרו על הפלסמיד prpsM-GFP (חלבון פלואורסצנטי ירוק).
2. ביום הניסוי, הגדירו את אינקובטור הקופסה (איור 1A) ל-37 מעלות צלזיוס כמה שעות לפני הניסוי כדי להבטיח טמפרטורה אחידה ויציבה לפני שמתחילים. לאחר מכן, הגדירו את משאבת המזרק ואת לוחית הזכוכית המחוממת על במת המיקרוסקופ (איור 1B,C), וקבעו את הטמפרטורה באותה טמפרטורה כמו חממת הקופסה.
   הערה: חממת הקופסה שבה כל המערכת, כולל המיקרוסקופ (איור 1E), סגורה מבטיחה שמירה על טמפרטורה אחידה וקבועה לאורך כל הניסוי כאשר התעלה נשטפת במדיום.
3. תשעים דקות לפני הניסוי, הכניסו את השבב המיקרופלואידי לכלי מלא ב-100% אתנול (EtOH) ושטפו את התעלה ב-100% EtOH למשך 10 דקות לפחות. הנח את השבב המיקרופלואידי במייבש ואקום והוציא את הגז למשך 30 דקות לפחות. החלף את ה-EtOH במים מזוקקים וטפל בשבב בוואקום למשך 30 דקות לפחות. הכניסו את השבב המיקרופלואידי לתנור בחום של 70 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות כדי להסיר עקבות של נוזלים שנותרו בתעלה.
   הערה: שלב זה הכרחי כדי למנוע היווצרות בועות בתעלה כאשר הוא נשטף במדיום תרבות.
4. פיפטה 1 מ"ל של מדיום 3-(N-morpholino) חומצה פרופנסולפונית (MOPS) (1x) לתוך בקבוקון צנטריפוגה והוסף 10 מיקרוליטר של 0.132 M אשלגן פוספט (K₂HPO₄). הוציאו את תרבית הלילה מהחממה של 37 מעלות צלזיוס והכניסו 100 מיקרוליטר לבקבוקון הצנטריפוגה וצנטריפוגה את התרבית ב-2,300 × גרם למשך 2 דקות. פיפטה בעדינות את הסופרנטנט מתוך בקבוקוני הצנטריפוגה, והשעו מחדש את הגלולה ב-1 מ"ל של מדיום MOPS טרי עם 0.015% v/v של Tween 20 ו-0.01% v/v של אשלגן פוספט.
   הערה: הריכוז האופייני של תרחיף החיידקים הוא בטווח של 0.015-0.15 נפח, מה שמבטיח היווצרות אזור הצטברות מורחב ונייד ומונע הצטברות חלקיקים על המצע. החלפת מדיום הלילה במדיום טרי ממזערת את הסיכון לשחרור סרטי חיידקים על התבנית. היעדר מקור פחמן במדיום הטרי מונע תאים לצמוח בתרחיף במהלך דפוס התבנית. ריכוז של 0.015% v/v של Tween 20 במתלה נחוץ כדי שזווית המגע של הנוזל הנסוג בתבנית ה-PDMS תיפול בטווח האופטימלי, בין 30 ל-60°.
5. טען את תרחיף החיידקים במזרק של 1 מ"ל וחבר את המזרק לשבב דרך צינורות מיקרופלואידיים.
   1. כדי לאבטח את החיבור בין המזרק לצינור, הכנס ישירות מחט בקוטר חיצוני של 0.6 מ"מ לתוך הצינור. כדי למנוע פיזור כל מתלה שנותר בסביבת הכניסה על פני התעלה, שטוף מדיום טרי דרך החור המשמש כיציאה במהלך תהליך הדפוס (איור 2A-III), במקום החור המשמש ככניסה.
   2. התקן את המזרק על משאבת המזרק והזריק את המתלה לשבב המיקרופלואידי דרך הכניסה הממוקמת בחלק במעלה הזרם של התעלה עד שהמתלה מכסה את אזור התבנית במלכודות. הערה: בתהליך הזרקת הנוזל, אוויר יכול לברוח דרך שקע הממוקם בקצה הזרם של התעלה.
   3. הגדר את משאבת המזרק למשוך את תרחיף החיידקים (איור 2A-I) בקצב זרימה של 0.07-0.2 מיקרוליטר לדקה, אשר בגיאומטריה המתוארת מתאים למהירות נסיגת מניסקוס של 80-100 מיקרומטר לדקה.
   4. עקוב אחר תהליך הדפוס באמצעות תוכנת מיקרוסקופ.
      הערה: כאן, נעשה שימוש בהגדלה של פי 10 כדי לנטר את המניסקוס הנסוג על התבנית, והגדלה של פי 20 שימשה לניטור שקיעה של חיידקים בודדים במלכודות המיקרו-מפוברקות.
6. לאחר שהתבנית עוצבה עם תאים (איור 2A-II), הגדל את קצב זרימת הנסיגה כדי לרוקן במהירות את התעלה המיקרופלואידית ולשטוף אותה עם LB טרי שהוסר בעבר למשך 30 דקות לפחות והתחמם מראש ב-30 מעלות צלזיוס.
7. הגדר את משאבת המזרק בקצב זרימה של 2 מיקרוליטר לדקה כדי לשטוף בעדינות את התעלה. לאחר מילוי הערוץ, הגדל את קצב הזרימה (15 מיקרוליטר לדקה) בהתאם לצרכי הניסוי הספציפיים.
8. רכוש תמונות של חיידקים גדלים בהגדלה ובמרווח הזמן הרצויים.

תוצאות

איור 1: סכמטי של הפלטפורמה עבור הרכבה בסיוע נימי רציף בתעלה מיקרופלואידית. (א) אינקובטור קופסה. חממת הקופסה שומרת על טמפרטורה אחידה וקבועה (כאן, 30 מעלות צלזיוס) בתוך התעלה המיקרופלואידית. (ב) מזרק טעון בתרחיף נוזלי. המזרק נשלט על ידי משאבת ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מזרק BD 10 מ"ל (Luer-Lock)	ב.ד.	300912	משמש לשטיפת מרק ליזוגני טרי לתעלה המיקרופלואידית
חממת קופסאות	שירותי הדמיית חיים		משמש להבטחת טמפרטורה אחידה וקבועה בתעלה
צנטריפוגה	אפנדורף	ר5424ר	משמש להחלפת מדיית הלילה במדיה מינימלית טרייה
בקבוקון צנטריפוגה	אפנדורף	30120086	1.5 מ"ל
בסיס CETONI 120	CETONI GmbH		משאבת מזרק
H401-T-בקר	אוקולאב		בקר צלחת הזכוכית המחוממת
H601-ניקון-TS2R-זכוכית	אוקולאב		צלחת זכוכית מחוממת
מזרקי אינסולין, U 100, עם לואר	קודן מדיקל ApS	CODA621640	מזרק 1 מ"ל המשמש למשיכת המתלה הנוזלי במהלך תהליך הדפוס
מרק LB, מילר (לוריא-ברטני)	פישר סיינטיפיק	244610	מרק ליזוגני נשטף לתעלה המיקרופלואידית
צינורות העברה Masterflex	מאסטרפלקס	HV-06419-05	מזהה 0.020 אינץ', 0.06 אינץ' OD
מגבים (פי 10)	טקנובה	M2101	מדולל פי עשרה במי milliQ ומשמש להחלפת מדיום הלילה
ניקון אקליפס Ti2	מכשירי ניקון		מיקרוסקופ
אשלגן פוספט דו-בסיסי	סיגמא אולדריץ'	עמ' 3786	נוסף ל-MOPS 1x
טווין 20	סיגמא אולדריץ'	עמ' 1379	משמש להבטחת זווית מגע נסיגה אופטימלית במהלך תהליך הדפוס