בדיקת חיישן ביולוגי חיידקי לזיהוי כספית זמינה ביולוגית בתנאים אנאירוביים

תקציר

מקור: Stenzler, B. R. et al., בדיקת חיישן ביולוגי אנאירובי לזיהוי כספית וקדמיום. J. Vis. Exp. (2018)

סרטון זה מדגים את השימוש בחיישנים ביולוגיים של חיידקים מהונדסים גנטית כדי למדוד במדויק את החלק הזמין ביולוגית של יוני כספית בתנאים אנאירוביים. על ידי שינוי ריכוז המגנזיום הגופרתי, הבדיקה מבטיחה שהחיישן הביולוגי מגיב באופן סלקטיבי ליוני כספית חופשיים, כפי שמצוין על ידי שינויים בעוצמת הקרינה.

פרוטוקול

1. בדיקת חשיפה

1. עיצוב פריסת צלחת.
   הערה: הקפד לחשב את כל ערכי הפיפטינג ולהכין מלאי לפני תחילת בדיקת החשיפה. כיצד לתכנן נכון ניסוי ואילו בקרות לכלול מפורט בטקסט. בנוסף, אין להתחיל בניסוי אם יש חמצן בתא האנאירובי המצוין במוניטור האנאירובי.
2. עצב את פריסת הצלחת על פי תבנית של 96 בארות. זה יאפשר ל-32 טיפולים שונים להריץ ניסויים בשכפולים טכניים של 3, המיוצגים בצורה הטובה ביותר על ידי רשת של 4 x 8 להגדרת בקבוקונים (ראה איור 1).

הערה: כאשר בודקים את תפקידו של משתנה על ספיגת כספית עם החיישן הביולוגי המעורר כספית, נדרשים שני טיפולים לכל משתנה: הטיפול (חיישן ביולוגי + כספית (כספית) + משתנה + חנקה) והטיפול בו ריק (חיישן ביולוגי + משתנה + חנקה). כאשר בודקים את תפקידו של משתנה על הפיזיולוגיה של התא באמצעות החיישן הביולוגי המכונן, נדרשים שני טיפולים לכל משתנה: הטיפול (חיישן ביולוגי + כספית + משתנה + חנקה) והטיפול ריק (חיישן ביולוגי + משתנה + כספית). כספית עשויה להיות מוחלפת בקדמיום (Cd). Hg או Cd יהפכו למשתנה בעת ביצוע עקומת כיול. אין צורך להפעיל את החיישנים הביולוגיים המכוננים והניתנים להשראה בו זמנית (באותה פריסת לוח). דוגמה לתבנית לפריסת הצלחת ורשת 4 x 8 מתאימה בעת בדיקת טווח ריכוז של מגנזיום (משתנה) מסופקת בטבלה 1.

2. הגדר את הרשת 4 x 8 בהתאם לפריסת לוחית הבדיקה.

1. הניחו בקבוקונים סטנדרטיים של 7 מ"ל פוליטטרפלואורואתילן (PTFE) במגש.
הערה: יש לשטוף את בקבוקוני PTFE בחומצה או לעקר אותם בחום לפני השימוש. יש לטפל בהם רק על ידי מניפולציה של החלק החיצוני של הבקבוקון.

2. לכל בקבוקון, הוסף את נפח אמצעי החשיפה המתאים לכל טיפול.
הערה: בחשיפה בנפח כולל של 2,000 מיקרוליטר (2 מ"ל), מדיום החשיפה הנוסף יהיה: מדיום חשיפה μL = 2,000 μL - טיפול (ריק) μL. (למשל, מדיום חשיפה μL = 2,000 - 100 μL (חיישן ביולוגי) - 40 מיקרוליטר (חנקה) - 100 מיקרוליטר (כספית) - 100 מיקרוליטר (משתנה (למשל, מגנזיום גופרתי, MgSO₄)) = 1660 מיקרוליטר). ודא שהנפח שנוסף של המשתנה שנבדק אינו עולה על 5% (100 מיקרוליטר) מהנפח הסופי.

3. הוסף את הנפח המתאים של התמיסה של המשתנה הכימי שייבדק לכל בקבוקון, בהתאם לפריסת הצלחת.

4. הוסף חנקה לכל בקבוקון כך שהריכוז הסופי יהיה 200 מיקרומטר (40-80 מיקרוליטר). אל תכלול שלב זה עבור החסר של טיפול ביו-חיישן מכונן.

5. הוסף Hg (5 ננומטר בעת בדיקת משתנה) או Cd (300 ננומטר בעת בדיקת משתנה) לבקבוקונים בהתאם לפריסת הצלחת. אל תכלול שלב זה עבור החסר לטיפול בחיישן ביולוגי המעורר כספית.

1. בעת שימוש בכספית, קח את ציר 4-8 מיקרומטר ונער היטב. לדלל את התמיסה במדיום חשיפה בבקבוקון PTFE של 7 מ"ל ל-100-250 ננומטר כדי ליצור תמיסת כספית עובדת. מפתרון עבודה זה, הוסף Hg לבקבוקונים הנדרשים. במקרה זה, עקומת כיול של כספית הנעה בין 0 ל -12.5 ננומטר.
הערה: בעת בדיקת השפעת משתנה על הזמינות הביולוגית של Hg או Cd, ודא ש-[Hg] או [Cd] נשאר קבוע בכל הטיפולים. בעת הוספת Hg או Cd, הקפד להשתמש בקצה פיפטה אחד, אך לעולם אל תיגע במדיום החשיפה בבקבוקונים.

נער בתנועה מסלולית באופן ידני.
הערה: הניסוי עשוי להיות מושהה כעת בהתאם לזמן הנדרש ל-Hg או Cd להתמיין בתמיסה. אם משאירים אותו יותר משעה, הניחו מכסי PTFE על בקבוקוני ה-PTFE כדי למנוע אידוי/זיהום.

פיפטה בעדינות את מלאי החיישנים הביולוגיים קדימה ואחורה כדי להבטיח הומוגניות. הוסף 100 מיקרוליטר של מלאי חיישנים ביולוגיים לכל בקבוקון. לנער באופן ידני את המסלול.

הכן את קורא הצלחות להתחמם לקריאה עם הקריטריונים הבאים: טמפרטורה ב-37 מעלות צלזיוס, ריצה קינטית במשך 10 שעות עם קריאות כל 2.5-5 דקות עם טלטול מסלולי בין קריאות, ומדידות פלואורסצנטיות עם עירור פלואורסצנטי של 440 ננומטר ופליטה של 500 ננומטר.

פיפטה 200 מיקרוליטר מכל בקבוקון PTFE ברשת 4 x 8 לבארות המתאימות של צלחת 96 הבארות (מיקרו-לוחות משטח שחורים, 96 בארות שקופים לא מחייבים). פיפטה קדימה ואחורה חמש פעמים לפני העברת כל 200 מיקרוליטר.הערה: במקום להשליך את קצה הפיפטה, השאר את קצה הפיפטה בבקבוקון ה-PTFE כדי לעקוב אחר התקדמות הפיפטה.

הנח את צלחת 96 הבארות במגש של קורא הצלחות, ולאחר מכן הנח את המכסה על צלחת 96 הבארות והתחל בבדיקה.

 

טבלה 1: דוגמה לפריסת לוחות לשימוש בחיישן הביולוגי לבדיקת זמינות ביולוגית של כספית (5 ננומטר) על פני שיפוע של מגנזיום (0-10 מ"מ)

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

a

חיישן ביולוגי מושרה כספית + כספית + ניטראט + 0 מ"ג

חיישן ביולוגי מושרה כספית + ניטראט + 0 מ"מ מ"ג

חיישן ביולוגי מכונן + כספית + ניטראט + 0 מ"מ מ"ג

חיישן ביולוגי מכונן + כספית + 0 מ"מ מ"ג

b

חיישן ביולוגי מושרה כספית + כספית + ניטראט + 0.1 מ"מ מ"ג

חיישן ביולוגי מושרה כספית + ניטראט + 0.1 מ"מ מ"ג

חיישן ביולוגי מכונן + כספית + ניטראט + 0.1 מ"מ מ"ג

חיישן ביולוגי מכונן + כספית + 0.1 מ"מ מ"ג

c

חיישן ביולוגי מושרה כספית + כספית + ניטראט + 1 מ"מ מ"ג

חיישן ביולוגי מושרה כספית + ניטראט + 1 מ"מ מ"ג

חיישן ביולוגי מכונן + כספית + ניטראט + 1 מ"ג

חיישן ביולוגי מכונן + כספית + 1 מ"מ מ"ג

d

חיישן ביולוגי מושרה כספית + כספית + ניטראט + 10 מ"ג

חיישן ביולוגי מושרה כספית + ניטראט + 10 מ"מ מ"ג

חיישן ביולוגי מכונן + כספית + ניטראט + 10 מ"ג

חיישן ביולוגי מכונן + כספית + 10 מ"מ מ"ג

חומרים