סינון מעכבים של פירופוסטאז הקשור לממברנה חיידקית באמצעות בדיקה קולורימטרית

תקציר

מקור: Vidilaseris, K., et al. הקרנה למעכבי פירופוספאטאז הקשורים לממברנה של Thermotoga maritima . J. Vis. Exp. (2019)

סרטון זה מדגים בדיקה קולורימטרית לסינון מעכבים של פירופוספאטאז הקשור לממברנה חיידקית (mPPase) על ידי כימות שחרור אורתופוספט. השיטה מאפשרת זיהוי תרכובות המעכבות mPPase מ-Thermotoga maritima, מטרה פוטנציאלית לתרופה אנטי-מיקרוביאלית.

פרוטוקול

1. ריאגנטים להכנת הבדיקה

1. הכן את תמיסת הארסן-ציטראט.
   1. שקלו 5 גרם נתרן ארסניט ו-5 גרם טריסודיום ציטראט דיהידרט.
      זהירות: נתרן ארסניט רעיל; לכן השתמש בציוד מגן מתאים וטפל בזהירות מיוחדת. כאמצעי זהירות, אל תטפל לפני שנקראו והובנו כל אמצעי הבטיחות הדרושים. יש לטפל רק במכסה אדים על מנת לא לשאוף אבק/אדים של התרכובת או התמיסות שלה. אם נשאפים, עברו לאוויר צח וקבלו טיפול רפואי. הרכיבו משקפי בטיחות כימיים מתאימים, כפפות מגן וביגוד כדי למנוע בליעה ומגע בעיניים/עור. במקרה של בליעה, יש להתקשר מיד למרכז רעלים או לרופא/רופא. אם הוא עולה על העור או בעיניים, יש לשטוף עם הרבה מים ולפנות לטיפול רפואי.
   2. ממיסים ל 100 מ"ל מים.
   3. מוסיפים 5 מ"ל חומצה אצטית קרחונית מערבבים ומוסיפים מים ל -250 מ"ל.
   4. יש לאחסן בטמפרטורת החדר, מוגן מאור.
      הערה: הפתרון יציב במשך יותר משנה.
2. הכן פתרון A ופתרון B.
   1. לתמיסה A, הוסף 10 מ"ל של 0.5 M HCl (חומצה הידרוכלורית) קרה כקרח ל-0.3 גרם חומצה אסקורבית. ממיסים את החומצה האסקורבית על ידי מערבולת.
   2. לתמיסה B, יש להוסיף 1 מ"ל מים קרים כקרח ל-70 מ"ג אמוניום הפטמוליבדט טטרהידרט ומערבולת כדי להתמוסס.
      הערה: אחסן את שתי התמיסות על קרח עד לשימוש. לצורך עקביות תוצאת הבדיקה, ניתן לאחסן את שתי התמיסות על קרח למשך שבוע לכל היותר.
3. הכן את תקן הפוספט (Pi) בריכוז של 0 מיקרומטר, 62.5 מיקרומטר, 250 מיקרומטר ו-500 מיקרומטר לכיול.
   1. הוסף 0 מיקרוליטר, 25 מיקרוליטר, 50 מיקרוליטר ו-100 מיקרוליטר של 5 מ"מ Na₂HPO₄ (דיסודיום פוספט) דיהידרט לארבעה מיקרו-צינורות המכילים 370 מיקרוליטר מתערובת התגובה.
   2. מלאו עד 1 מ"ל במים.

2. בדיקת פעילות לצלחת אחת של 96 בארות

הערה: ראה איור 1 לזרימת העבודה הסכמטית של הבדיקה.

1. הוסף 1 מ"ל של תמיסה B ל-10 מ"ל של תמיסה A, ערבב על ידי מערבולת ואחסן את התמיסה על קרח.
   הערה: פתרון זה צריך להיות שקוף וצהוב. יש לשמור את תמיסה A + B על קרח למשך 30 דקות לפחות לפני השימוש. עם זאת, השתמש בתמיסה תוך 3 שעות מכיוון שהיא תתקלקל לאחר אחסון לטווח הארוך.
2. הוסף 40 מיקרוליטר של 0 מיקרומטר, 62.5 מיקרומטר, 250 מיקרומטר ו-500 מיקרומטר תקן Pi לרצועות הצינור בטריפליקט באמצעות פיפטה רב-ערוצית.
   הערה: תערובת התגובה ללא תוספת Pi תשמש כריק.
3. הוסף 25 מיקרוליטר של תמיסה מורכבת לרצועות הצינור באמצעות פיפטה רב ערוצית.
   הערה: לכל תרכובת יש שלושה ריכוזים שונים בטריפליקט וזה מספיק להערכה ראשונית של ריכוז המעכב החצי מקסימלי (IC50). לקביעת IC50 מדויקת יותר, ניתן להשתמש בשמונה ריכוזי תרכובות שונים. עבור האנזים הבלתי מעוכב, תמיסת התרכובת מוחלפת בכמות שווה של מים. כבקרות חיוביות נעשה שימוש ב-2.5 מיקרומטר, 25 מיקרומטר ו-250 מיקרומטר של מלח נתרן אימידודיפוספט (IDP).
4. הוסף 15 מיקרוליטר של תערובת תמיסת mPPase (פירופוספטאז קשור לממברנה) לרצועות הצינור (למעט הצינורות המכילים תקן Pi) באמצעות פיפטה רב-ערוצית.
5. אטום את רצועות הצינור ביריעת איטום דביקה. חותכים את יריעת האיטום כדי להפריד כל רצועת צינור.
6. הדגירה מראש של הדגימות למשך 5 דקות בטמפרטורה של 71 מעלות צלזיוס. הנח את הדגימות על בלוק החימום במרווח של 20 שניות בין כל רצועה על מנת למזער את צריכת הזמן במהלך השלבים הבאים.
7. עבור כל רצועה, פתח את איטום הדבק. הוסף 10 מיקרוליטר של 2 מ"מ נתרן פירופוספט דיבאסיק באמצעות פיפטה רב-ערוצית וערבב על ידי פיפטה למעלה ולמטה למשך 5×. אטום שוב את רצועת הצינור באמצעות אותו איטום.
   הערה: שלב זה עשוי להיות קשה לביצוע בתחילה תוך 20 שניות; עם זאת, זה יהפוך לקל יותר לאחר כמה בדיקות.
8. דגירה בטמפרטורה של 71 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
9. הנח את הדגימות על מכשיר הקירור במרווח של 20 שניות בין כל רצועה. הניחו להם להתקרר במשך 10 דקות אך צנטריפוגה כל רצועה לזמן קצר לאחר 5 דקות של קירור, כדי לשפוך טיפות מים מתחת ליריעת האיטום, ואז החזירו אותם למנגנון הקירור והסירו את האיטום.
   הערה: ניתן פשוט לייצר את מנגנון הקירור על ידי הנחת צלחת PCR (תגובת שרשרת פולימראז) בת 96 בארות על צלחת פטרי פוליסטירן (גודל 150 מ"מ × 15 מ"מ) מלאה במים והקפאה למשך שעה לפחות. יש להוציא את המכשיר מהמקפיא כ-5 דקות לפני תחילת הבדיקה. אין להוציא את מכשיר הקירור ממש לפני קירור הדגימה מכיוון שהוא יקפיא את תערובת התגובה ויעכב את התפתחות הצבע.
10. לאחר 10 דקות של קירור, מוסיפים 60 מיקרוליטר של תמיסה A + B, מערבבים על ידי פיפטינג למעלה ולמטה למשך 5×, ושומרים את רצועות הצינור על מכשיר הקירור למשך 10 דקות.
11. הוסף 90 מיקרוליטר מתמיסת הארסן-ציטראט ושמור בטמפרטורת החדר לפחות 30 דקות כדי ליצור צבע כחול יציב.
    זהירות: בשל רעילותו, יש לטפל בכל התמיסות המכילות נתרן ארסניט בזהירות יתרה בכל עת. לפיכך, תוספת של תמיסת ארסן-ציטראט צריכה להיעשות במכסה אדים.
12. הוציאו 180 מיקרוליטר מכל תערובת תגובה למיקרו-פלטת פוליסטירן שקופה של 96 בארות.
13. מדוד את הספיגה של כל באר ב-860 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר מיקרו-פלטה.

תוצאות

איור 1: זרימת עבודה סכמטית של מבחן עיכוב TmPPase בפורמט לוח של 96 בארות. המספור האדום מציג את שלבי הבדיקה לפי הפרוטוקול, והחצים הכחולים מציגים את סדר מרווחי הזמן. TmPPase: mPPase מהחיידק התרמופילי Thermotoga maritima.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
גיליון איטום דבק	תרמו סיינטיפיק	AB0558
אמוניום הפטמוליבדט טטרהידראט	מרק	F1412481 636
חומצה אסקורבית	סיגמא-אולדריץ'	ברקוד 95212-250 גרם
BioLite 96Well מולטיפיש	תרמו סיינטיפיק	130188
דימתיל סולפוקסיד (DMSO)	מרק	1167431000
רצועות צינור PCR 8 בארות 0.2 מ"ל ללא פקקים (120)	גנטיקה של ניפון	FG-028
אתנול	מרק	1009901001
חומצה אצטית קרחונית	מרק	1000631011
חומצה הידרוכלורית	סיגמא-אולדריץ'	258148-500 מ"ל
מלח נתרן אימידודיפוספט	סיגמא-אולדריץ'	I0631-1G
מגנזיום כלוריד	סיגמא-אולדריץ'	8147330500
צלחות PCR מרובות 96 בארות	ביו-ראד	MLL9651
מולטיסקאן גו	תרמו סיינטיפיק	10680879
עליית נפלוסקאן (סוג 750)	מערכות מעבדה
צלחת פטרי מפוליסטירן (גודל 150 מ"מ על 15 מ"מ)	סיגמא-אולדריץ'	P5981-100EA
אשלגן כלורי	מרק	104936
תוכנת פריזמה 6	GraphPad
בלוק חימום QBT2	מכשירי מענק
נתרן מטא-ארסניט	פישר כימיקלים	12897692
נתרן פוספט דו-בסיסי (Pi)	סיגמא	S0876-1 ק"ג
נתרן פירופוספט דו-בסיסי	פלוקה	71501-100 גרם
טריסודיום ציטראט דיהידראט	פלוקה	71404-1 ק"ג