הדמיה של חלבוני נביטה בקרום הפנימי של נבגי חיידקים

תקציר

מקור: Wen, J., Pasman, et al., Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores. J. Vis. Exp. (2019)

סרטון זה מדגים את השימוש במיקרוסקופ תאורה מובנה לרכישת תמונות פלואורסצנטיות תלת מימדיות החושפות את ארגון חלבוני הנביטה בתוך נבג החיידקים.

פרוטוקול

1. הדמיית חלבון נביטה (תזמון: 1 שעות)
   1. צלם את תמונות השידור והפלואורסצנטיות של נבגים וכן תערובת של מיקרוספירות פלואורסצנטיות אדומות וצהובות שעברו שינוי קרבוקסילט במיקרוסקופ תאורה מובנה (ראה טבלת חומרים) המצויד באובייקט שמן פי 100 (צמצם מספרי = 1.49), מצלמת CCD (התקן מצמד מטען) ותוכנת ניתוח תמונה (ראה טבלת החומרים). צור את כל התמונות בטמפרטורת החדר ללא הפרעה של אור הסביבה. הקפד תמיד לנקות את המטרה פי 100 ואת השקופית עם 75% אתנול לפני ההדמיה.
   2. התמקד במיקרוספירות פלואורסצנטיות של 100 ננומטר (קוטר) ובצע אופטימיזציה של פונקציית התפשטות הנקודה (psf) על ידי התאמת טבעת התיקון באובייקט פי 100 עד לקבלת psf סימטרי, ובכך למזער את טשטוש התמונה. ה-psf הוא תגובת הדחף או התגובה של מערכת הדמיה למקור נקודתי או לאובייקט נקודתי.
   3. בחר שדה ראייה עם כ-10 מיקרוספירות פלואורסצנטיות עגולות. החל התאמת מיקוד סורג עבור אורכי גל עירור של 561 ננומטר ו-488 ננומטר כמדריך לתוכנת ניתוח התמונה.
   4. מקד את הנבגים עם נורית השידור וצלם תמונת אור שידור במצב ממוצע של 16× עם חשיפות של 200 אלפיות השנייה לכל תמונה.
   5. צלם תמונות פלואורסצנטיות גולמיות 3D-SIM של הנבגים עם מצב התאורה "3D-SIM", הגדרות המצלמה למצב קריאה רווח הכפלת אלקטרונים (EM) 10MHz ב-14 סיביות, ורווח EM ב-175. עורר את בדיקת FM4-64 בנבגי PS4150 עם אור לייזר של 561 ננומטר בעוצמת לייזר של 20% וזמן הארה של 400 אלפיות השנייה.
   6. עורר את GerKB-mCherry ו-GerD-GFP בנבגי KGB80 עם, בהתאמה, אור לייזר של 561 ננומטר בעוצמת לייזר של 30% למשך 1 שניות, ואור לייזר של 488 ננומטר ב-60% עוצמת לייזר למשך 3 שניות. הגדרות Z-Stack הן במצב מלמעלה למטה, 0.2 מיקרומטר/שלב.
      הערה: פרמטרי לייזר אלה יושמו כדי להבטיח ערך בהירות מקסימלי של כ-4,000 עבור חלון ההיסטוגרמה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מגלשות זכוכית מיובשות באוויר	Menzel Gläser	630-2870
APO TIRF N20R8 100× מטרת נפט (NA=1.49)
בצילוס סבטיליס KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mחתול דובדבן, gerD-gfp kan)
בצילוס סבטיליס PS4150 (PS832 ΔgerE::spc, ΔcotE::tet)
מיקרוספירות FluoSpheres שעברו שינוי קרבוקסילט	אינוויטרוגן, 0.1 מיקרומטר	F8803
FM4-64	תרמו פישר סיינטיפיק	פ34653
תווך שיפוע צפיפות נון-יוני של היסטודנז	סיגמא-אולדריץ'	D2158
תמונה J
מצלמת iXON3 DU-897 X-6515 CCD	טכנולוגיית אנדור		https://imagej.net/Welcome
תוכנת הדמיה מיקרוסקופ	Nikon, יפן	NIS-אלמנט AR 4.51.01
MilliQ מים טהורים במיוחד	מיליפור	מילי-Q IQ 7003
מיקרוסקופ Nikon Eclipse Ti
כיסויים מדויקים	פול מרינפלד	117650
צינורות מכסה בורג 50 מ"ל	תרמו פישר סיינטיפיק		נונק TM