טרנספקציה של אמבה מסוג בר באמצעות אלקטרופורציה עם תמיכה בהזנת חיידקים

תקציר

מקור: Paschke, P., et al. הנדסה גנטית של תאי Dictyostelium discoideum על בסיס ברירה וצמיחה על חיידקים. J. Vis. Exp. (2019).

סרטון זה מדגים את ההליך להחדרת פלסמיד הנושא גן מטרה לתאי אמבה באמצעות אלקטרופורציה, ולאחר מכן התאוששות בתוסף חיידקי כדי לאפשר העברת גנים יעילה באמבה מסוג בר.

פרוטוקול

1. הגדרת תאי דיקטיוסטליום לטרנספקציה
   1. גדל את Klebsiella aerogenes למפגש במדיום SM (חלב רזה) (מדיום עשיר בחומרים מזינים) למשך הלילה ב-RT (טמפרטורת החדר). ניתן לאחסן תרביות עד שבועיים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
   2. הוסיפו כ-400 מיקרוליטר של תרחיף חיידקים זה על צלחת אגר SM (פפטון 10 גרם/ליטר; תמצית שמרים 1 גרם/ליטר; גלוקוז 10 גרם/ליטר; KH₂PO₄ 1.9 גרם/ליטר; K₂HPO₄ x 3 H₂O, 1.3 גרם/ליטר; MgSO₄ נטול מים 0.49 גרם/ליטר; 1.7% אגר) ולהתפשט באופן שווה. קח לולאה סטרילית וחסן בתאי דיקטיוסטליום . מורחים את התאים בקצה אחד של הצלחת.
   3. דגרו את הצלחת בטמפרטורה של 22 מעלות צלזיוס למשך יומיים כדי להבטיח אזורי גידול גדולים מספיק להעברה.
      הערה: עבור זני Dictyostelium שאינם מייצרים אזורי גדילה גדולים (למשל, Ax3, DH1 או JH10), או עבור נסיינים חסרי ניסיון, השתמש במקום זאת בפלטות ניקוי.
   4. קח לולאה סטרילית וחסן בתאי דיקטיוסטליום (כ 2-4 x 10⁵ תאים). העבירו את התאים ל-800 מיקרוליטר של תרחיף צפוף של K. aerogenes ב-SM. ערבבו תאים על ידי פיפטינג למעלה ולמטה.
   5. העבר 400 מיקרוליטר, 200 מיקרוליטר, 100 מיקרוליטר ו-50 מיקרוליטר על לוחות אגר SM טריים. הוסף לכל צלחת 400 מיקרוליטר של תרחיף SM K. aerogenes נוסף, מורחים באופן שווה ומייבשים.
   6. דגרו את הצלחות בחום של 22 מעלות צלזיוס למשך כיומיים עד שהצלחות הופכות שקופות.
      הערה: בשל קצב הצמיחה המהיר שלהם, החיידקים מייצרים בתחילה מדשאה מתכנסת, והאמבות לאחר מכן "מנקים" את צלחת החיידקים. הזמן הנדרש לתהליך זה יכול להשתנות בהתאם לרקע הזן וליכולתם של תאים מוטנטיים לגדול על חיידקים.

2. טרנספקציה של תאי דיקטיוסטליום על בסיס ברירה חיידקית

1. להכנת צלחות עם תרחיף K. aerogenes , הוסף 10 מ"ל של מאגר SorMC המכיל חיידקי K. aerogenes לצפיפות של OD (צפיפות אופטית)₆₀₀ = 2 (הוסף 200 מיקרוליטר מתמיסת מלאי OD₆₀₀ = 100 K. aerogenes המוכנה לריכוז החיידקים הרצוי) לצלחת פטרי שטופלה בתרבית רקמה בגודל 10 ס"מ.
   הערה: מאוחר יותר יש צורך בצלחת זו כדי לגדל את תאי D. discoideum שעברו טרנספטציה. לחלופין, ניתן להשתמש בצלחת תרבית רקמות עם 6 בארות. במקרה של טרנספקציה של הפלסמידים החוץ-כרומוזומליים, צלחת תרבית הרקמות בת 6 הבארות חסכונית יותר במשאבים. השתמש ב-2 מ"ל של תרחיף K. aerogenes SorMC (OD₆₀₀ = 2) לכל באר.
2. הכנת תאי דיקטיוסטליום
   1. בעזרת לולאת חיסון חד פעמית של 10 מיקרוליטר, מגרדים תאים מאזורי הגידול (כ -3 ס"מ) של צלחת התרבות (קצה האזור המנוקה) או צלחת הפינוי. העבירו תאים לצינור של 1.5 מ"ל המכיל 1 מ"ל של מאגר H40 קר כקרח.
      הערה: העיתוי של קצירת תאים מצלחות ניקוי הוא קריטי. קציר מוקדם מדי מניב כמות קטנה מדי של תאים, בעוד שקציר מאוחר מגדיל את הסיכון להניב תאים מפותחים חלקית.
   2. שטפו את התאים על ידי סיבוב כלפי מטה למשך 2 דקות ב-1,000 x גרם או סיבוב בזק במשך 2 שניות ב-10,000 x גרם. השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את התאים במאגר H40 לצפיפות סופית של 2-4 x 10⁷ תאים/מ"ל. שמור על התאים קרים במהלך כל הליך הטרנספקציה. השתמש בתרחיץ מי קרח כדי להבטיח מגע ישיר של הצינורות והקרח.
3. אלקטרופורציה
   1. הוסף 100 מיקרוליטר של תאים לצינור עם 1-2 מיקרוגרם DNA (חומצה דאוקסיריבונוקלאית). מערבבים בזהירות על ידי פיפטינג למעלה ולמטה.
   2. מעבירים את תערובת התא/DNA לקובטה אלקטרופורציה מקוררת מראש (מרווח של 2 מ"מ).
   3. דופק את התאים באמצעות הגדרות הגל הריבועי הבאות: 350 וולט, 8 אלפיות השנייה, 2 פולסים ומרווח דופק של 1 שניות.
      הערה: אין להוסיף יותר מ-2 מיקרוגרם DNA. כמויות גבוהות יותר רעילות לתאים ומפחיתות את יעילות הטרנספקציה. נפח ה-DNA הכולל שנוסף לא יעלה על 5 מיקרוליטר.
   4. העבירו תאים מיד לצלחת פטרי בגודל 10 ס"מ שהוכנה קודם לכן עם K. aerogenes SorMC ואפשרו לתאים להתאושש במשך 5 שעות.
      הערה: בדוק את התאים בצלחת פטרי תחת מיקרוסקופ הפוך. התאים יופיעו עגולים מיד לאחר האלקטרופורציה, אך יחזרו לצורתם האמבואידית לאחר כ-30 דקות, כאשר יהיה להם מספיק זמן להיצמד כראוי למשטח.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מיקרוצנטריפוגות אפנדורף 5424/5424R	תרמו-סיינטיפיק	05-400-002
צנטריפוגות Eppendorf 5702R עם רוטור דגם A-4-38	תרמו-סיינטיפיק	12823252
פורונה ארון בטיחות - SCANLAF	לאבוגן
ביופוטומטר פלוס	אפנדורף
CLSM 710	צייס
אגר מטוהר	אוקסואיד	LP0028
מרק SM	פורמדיום	SMB0102
2x מרק LB	פורמדיום	LBD0102
חומצה נטולת HEPES	סיגמא אולדריץ'/מרק	ברקוד 391340 EMD
KH₂PO₄	VWR	פ/4800/53
החל מ-HPO₄ 2 שעות₂O	VWR	10028-24-7
MgCl₂ 6 שעות₂O	סיגמא אולדריץ'/מרק	5982 EMD
CaCl₂ 2 שעות₂O	סיגמא אולדריץ'	442909
חומצה פולית	סיגמא אולדריץ'	F7876
KOH	VWR	26668.263
צלחת תרבית רקמות בסגנון 100 x 20 מ"מ, תרבית רקמות מטופלת	קורנינג קורפורייטד	353003
קובטות אלקטרופורציה בפער 2 מ"מ, אלקטרודה ארוכה	ג'נפלאו בע"מ	E6-0062
לולאת חיסון 10 מיקרוליטר, כחול 10 מיקרו ליטר	תרמו-סיינטיפיק	129399
מפזר, בצורת L, סטרילי	גריינר ביו-וואן	730190