העשרת ליפופרוטאינים חיידקיים באמצעות הפרדת פאזה של דטרגנט לא יוני

תקציר

מקור: Armbruster, K. M., Meredith, T. C. העשרה של ליפופרוטאינים חיידקיים והכנת ליפופפטידים N-terminal לקביעה מבנית על ידי ספקטרומטריית מסה. J. Vis. Exp. (2018)

סרטון זה מדגים את העשרת הליפופרוטאינים החיידקיים באמצעות חומר ניקוי לא יוני שעובר הפרדת פאזה עם ההתחממות. באמצעות שינויי טמפרטורה רציפים ושלבי צנטריפוגה, ליפופרוטאינים מחולקים באופן סלקטיבי לשלב חומר הניקוי, בעוד שמזהמים שאינם ליפופרוטאין מוסרים. לאחר מכן הליפופרוטאינים המועשרים משקעים, נשטפים ומושעים מחדש ליישומים במורד הזרם.

פרוטוקול

1. העשרת ליפופרוטאינים על ידי חלוקת פאזה Triton X-114 (TX-114)

1. השלם את הליזאט החיידקי עם חומר פעילי שטח TX-114 לריכוז סופי של 2% (נפח/נפח) על ידי הוספת נפח שווה של 4% (vol/vol) חומר פעילי שטח בתמיסת מלח / חומצה אתילנדיאמינטטראצטית (TBSE) קר כקרח ודגירה על קרח למשך שעה, ערבוב על ידי היפוך כל ~15 דקות.
   הערה: כאשר הוא מקורר, הסופרנטנט ופעילי השטח יהיו ניתנים לערבוב.
2. העבירו את הצינור לאמבט מים של 37 מעלות צלזיוס ודגרו למשך 10 דקות כדי לגרום להפרדת פאזה. צנטריפוגה את הדגימה ב-10,000 x גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר כדי לשמור על הפרדה דו-פאזית.
3. יש להסיר בעדינות את השלב המימי העליון ולהשליך. הוסף TBSE קר כקרח לשלב פעילי השטח התחתון כדי למלא מחדש את הצינור לנפחו המקורי ולהפוך אותו לערבוב. דגירה על קרח למשך 10 דקות.
4. העבירו את הצינור לאמבט מים של 37 מעלות צלזיוס ודגרו למשך 10 דקות כדי לגרום להפרדת פאזה, ולאחר מכן צנטריפוגה ב-10,000 x גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
5. חזור על שלבים 1.3-1.4 פעם נוספת ובסך הכל 3 הפרדות צבע. הסר את השלב המימי העליון והשליך.
6. הסר גלולה של חלבונים משקעים שנוצרו במהלך המיצוי (הנראה בתחתית הצינור), על ידי הוספת נפח אחד של TBSE קר כקרח לשלב פעילי השטח. צנטריפוגה ב-4 מעלות צלזיוס ב-16,000 x גרם למשך 2 דקות לחלבון בלתי מסיס.
   הערה: המדגם צריך להישאר שלב יחיד. אם מתרחשת הפרדת פאזה, יש לקרר מחדש את הדגימה והצנטריפוגה שוב. הגלולה מורכבת בדרך כלל ממזהמים שאינם ליפופרוטאין אך ניתן לשמור אותה לניתוח נוסף.
7. העבירו מיד את הסופרנטנט לצינור מיקרו-צנטריפוגה טרי של 2.0 מ"ל המכיל 1250 מיקרוליטר של 100% אצטון. פיפטה למעלה ולמטה ביסודיות כדי לשטוף את הדגימה מהקצה מכיוון שהיא תהיה צמיגה. מערבבים בהיפוך ודוגרים למשך הלילה בחום של -20 מעלות צלזיוס כדי לזרז חלבון.
8. צנטריפוגה את הדגימה ב-16,000 x גרם למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר כדי לגלול ליפופרוטאינים עם תשומת לב לכיוון הצינור. ליפופרוטאינים ייצרו סרט דק ולבן לאורך הדופן החיצונית של הצינור.
9. שוטפים את הגלולה פעמיים עם 100% אצטון. שפכו אצטון והניחו לדגימה להתייבש באוויר.
10. הוסף 20-40 מיקרוליטר של 10 מ"מ טריס-הידרוכלוריד, pH 8.0 או מאגר דגימה סטנדרטי של Laemmli SDS-PAGE והשהה מחדש ביסודיות על ידי פיפטינג למעלה ולמטה על הקיר עם הליפופרוטאינים המשקעים. מגרדים את צד הצינור עם קצה הפיפטה כדי לעקור ליפופרוטאינים.
    הערה: ליפופרוטאינים לא יתמוססו במאגר טריס אלא יהוו תרחיף.
    1. אחסן ליפופרוטאינים בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס עד לשימוש.

חומרים