מאמר שיטה

טיהור חלבוני תחום P רקומביננטיים שמקורם בחיידקים של נורו-וירוס אנושי

30 באוקטובר 2025

במאמר זה

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מקור: Leuthold, M. M., et al. ייצור תחומים בולטים של נורו-וירוס אנושי ב - E. coli לקריסטלוגרפיה של קרני רנטגן. J. Vis. Exp. (2016).

סרטון זה מדגים את הטיהור של תחום נורו-וירוס אנושי רקומביננטי P באמצעות כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל, תוך הדגשת ההפרדה של חלבון המטרה מזיהומים בעלי משקל מולקולרי גבוה ונמוך יותר בהתבסס על נגישות נקבוביות דיפרנציאלית. התהליך מנוטר על ידי ספיגת UV ומאושר באמצעות ניתוח SDS-PAGE של שברים שנפלטו.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. שלב הטיהור השלישי

  1. שטפו משאבות וצינורות של מערכת הטיהור HPLC (כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים) ואזנו מראש את עמודת ה-SEC (כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל) (ראה רשימת חומרים) עם GFB (מאגר סינון ג'ל).
  2. הזרקו את תחום ה-P לעמודה בקצב זרימה של 1 מ"ל/דקה באמצעות סופרלופ (עד 12 מ"ל) או לולאה (עד 3 מ"ל), בהתאם לנפח הדגימה המרוכזת. לאחר סיום ההזרקה, הגדל את קצב הזרימה ל-2.5 מ"ל/דקה.
  3. ככל שה-OD (צפיפות אופטית) גדל ותחום ה-P יורד מהעמודה, אסוף שברים של 1.5 מ"ל. בדוק שברים באמצעות SDS-PAGE עם ג'ל 12% (איור 1A ו-1B). אסוף רק את השברים הטהורים ביותר והתרכז ל ~ 3 מ"ג / מ"ל ו ~ 8 מ"ג / מ"ל.
    הערה: לאחר ~110 מ"ל (נפח ריק), רוב הזיהומים נפלטים מעמודת SEC עם נפח מיטה של 320 מ"ל. תחום P בדרך כלל מסומן כדימר. זמן/נפח של דימר דומיין P תלוי בדרגת ההכנה (pg) של עמודת ה-SEC.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
figure-results-1

איור 1. תוצאות סכמטיות ומייצגות עבור שלב הטיהור השלישי.
כרומטוגרמה של פליטת תחום P באמצעות SEC ותוצאת SDS-PAGE מתאימה. מספרים שחורים מציינים את השברים שנאספים. א) סכמטי של ההפרדה בעמודת ה-SEC (חרוזי SEC מתוארים ככדורים אפ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
DNA של תחום Pטכנולוגיות חיים סינתזת גנים של GeneArt
ויוספין 20GE Healthcareמגווןחיתוך של 10 kDa, 30 kDa ו- 50 kDa בשימוש
HiLoad 26/600 Superdex 75 PGGE Healthcare28-9893-34טור SEC

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

PUVSDS PAGEHPLC

מאמרים קשורים