טיהור סלקטיבי של חלבון חיידקי על ידי כרומטוגרפיה שלילית של חילופי יונים

תקציר

מקור: Kuo, T., et al. טיהור כרומטוגרפי שלילי בשלב אחד של חלבון המפעיל נויטרופילים הליקובקטר פילורי המתבטא יתר על המידה ב-Escherichia coli במצב אצווה. J. Vis. Exp. (2016)

הסרטון מדגים טכניקת כרומטוגרפיה שלילית לטיהור חלבון הקשור לאלימות מליזט חיידקים. על ידי שימוש בשרף טעון חיובי בתמיסה חוצצת, חלבוני התא המארח נשמרים באופן סלקטיבי, בעוד שחלבון המטרה הכמעט נייטרלי נשאר לא קשור ונאסף בזרימה. שיטה זו מאפשרת הפרדה והתאוששות יעילה של חלבון המטרה ליישומים במורד הזרם.

פרוטוקול

1. ביטוי של HP-NAP רקומביננטי ב-Escherichia coli (E. coli)

1. הכן את הפלסמיד pET42a-NAP המכיל את רצף ה-DNA של חלבון מפעיל נויטרופילים של הליקובקטר פילורי (HP-NAP) מזן הליקובקטר פילורי 26695 כפי שתואר קודם לכן. הכן את הפלסמידים המכילים את רצף ה-DNA של HP-NAP עם המוטציות הנקודתיות הרצויות.
2. הפוך 10 ננוגרם מפלסמידי ה-DNA הנ"ל לתאים מוכשרים E. coli BL21 (DE3) על ידי הלם חום למשך 45 שניות ב-42 מעלות צלזיוס, פס את התאים על צלחות אגר מרק ליזוגני (LB) המכילות 50 מיקרוגרם/מ"ל קנמיצין, ודגר את הצלחות ב-37 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות.
3. יש לחסן מושבות בודדות בשפופרות בודדות המכילות 5 מ"ל מרק LB עם 50 מיקרוגרם/מ"ל קנמיצין ולגדל אותן כתרביות מקדימות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות עם ניעור ב-170 סל"ד.
4. יש לחסן 2 מ"ל מתאי קדם-התרבית הנ"ל לתוך 200 מ"ל של מרק LB המכיל 50 מיקרוגרם/מ"ל קנמיצין בבקבוק של 1 ליטר. דגרו את בקבוק התרבית המחוסנת ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים עם ניעור ב-170 סל"ד עד שהספיגה ב-600 ננומטר מגיעה לכ-0.4-0.5 שזוהתה על ידי ספקטרופוטומטר אולטרה סגול (UV/VIS).
5. הוסף 80 מיקרוליטר של 1 M איזופרופיל β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) לתרבית הנ"ל לריכוז סופי של 0.4 מ"מ כדי לגרום לביטוי של HP-NAP. דגרו על התרבית למשך 3 שעות עד שהספיגה ב -600 ננומטר מגיעה לכ- 1.6-1.7.
6. צנטריפוגה של התאים ב-6,000 x g ב-4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות כדי להסיר את הסופרנטנט. אחסן את גלולת התא בטמפרטורה של -70 מעלות צלזיוס עד לטיהור.

2. הכנת חלק החלבון המסיס המכיל HP-NAP

הערה: כל השלבים הבאים מתבצעים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.

1. יש להשעות מחדש 50 מ"ל של גלולת התא שהוכנה בשלב פרוטוקול 1.6 ב-20 מ"ל של 20 מ"מ Tris-HCl, pH 9.0, 50 מ"מ NaCl המכיל 0.13 מ"מ פניל-מתיל-סולפוניל פלואוריד (PMSF), 0.03 מ"מ N-אלפא-טוזיל-L-ליזיניל-כלורומתילקטון (TLCK), ו-0.03 מ"מ N-tosyl-L-phenylalaninyl-chloromethylketone (TPCK) ב-4 מעלות צלזיוס כפי שתואר קודם לכן.
2. לשבש את תאי החיידקים על ידי העברת תרחיף החיידקים דרך הומוגנייזר בלחץ גבוה המופעל בטווח של 15,000 עד 20,000 psi למשך 7 פעמים ב-4 מעלות צלזיוס.
3. צנטריפוגה התא ליזאט ב-30,000 × גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת כדי להפריד בין חלקיקי החלבון המסיסים והבלתי מסיסים באמצעות אולטרה-צנטריפוגה. העבירו את הסופרנטנט כחלק החלבון המסיס לכוס.
4. מדוד את ריכוז החלבון של חלק החלבון המסיס בשיטת ברדפורד באמצעות ערכה מסחרית עם אלבומין בסרום בקר (BSA) כסטנדרט, בהתאם להוראות היצרן.
5. הוסף 177.6 מיקרוליטר של 1 N HCl ל-20 מ"ל של חלק החלבון המסיס שהתקבל משלב פרוטוקול 2.3 כדי להתאים את ערך ה-pH שלו מ-pH 9.0 ל-pH 8.0.
6. הוסף 20 מ"מ Tris-HCl, pH 8.0, 50 מ"מ NaCl לתמיסת החלבון הנ"ל כדי להפוך את ריכוז החלבון הסופי ל-0.5 מ"ג/מ"ל.

3. טיהור HP-NAP רקומביננטי מ - E. coli על ידי כרומטוגרפיה אצווה במצב שלילי עם שרפים להחלפת יונים של DEAE

1. הכן 15 מ"ל שרפים דיאתילאמינואתילים (DEAE).
   1. שקלו 0.6 גרם אבקה יבשה של שרפי DEAE והשעו אותה ב-30 מ"ל של 20 מ"מ Tris-HCl, pH 8.0, 50 מ"מ NaCl בטמפרטורת החדר למשך יום אחד לפחות.
   2. צנטריפוגה את השרף ב-10,000 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת.
   3. הסר והשליך את הסופרנטנט.
   4. הוסף 15 מ"ל של 20 מ"מ Tris-HCl, pH 8.0, 50 מ"מ NaCl.
   5. חזור על שלבי הפרוטוקול 3.1.2 עד 3.1.4 ארבע פעמים נוספות.
   6. אחסן את השרף השקוע של 15 מ"ל (50% slurry ב-30 מ"ל Tris buffer) ב-4 מעלות צלזיוס לשימוש לאחר מכן.
      הערה: כל השלבים הבאים מתבצעים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
2. הוסף 45 מ"ל מהחלבונים המסיסים שהוכנו בפרוטוקול שלב 2.6 עד 15 מ"ל של השרף וערבב את תמיסת החלבון/שרף עם מערבל מגנטי ב-4 מעלות צלזיוס למשך שעה.
3. יוצקים את תמיסת החלבון/שרף לתוך עמוד פלסטיק או זכוכית המצויד בתא עצירה. הניחו לשרף להתיישב תחת כוח הכבידה.
4. פתח את תא העצירה כדי לאפשר לתמיסת החלבון לעבור דרך העמודה על ידי זרימת כוח הכבידה עד שמפלס הנוזל בעמודה נמצא ממש מעל השרף. אסוף את הזרימה כשבר הלא קשור, המכיל את ה-HP-NAP המטוהר.
5. הוסף לעמודה 15 מ"ל של 20 מ"מ Tris-HCl, pH 8.0, 50 מ"מ NaCl.
6. פתח את תא העצירה כדי לאפשר למאגר הכביסה לעבור דרך העמוד על ידי זרימת כוח הכבידה עד שמפלס הנוזל בעמודה יהיה ממש מעל השרף. אסוף את הזרימה כשבריר הכביסה.
7. חזור על שלבי הפרוטוקול 3.5 עד 3.6 ארבע פעמים נוספות כדי לאסוף את שברי הכביסה הנוספים.

חומרים