נוהל לטיהור חלבון מתויג פוליהיסטידין מסטרפטוקוקוס מוטנס

תקציר

מקור: Murata, T., et al. טיהור חלבון בעל מסה מולקולרית גבוהה בסטרפטוקוקוס מוטנס. J. Vis. Exp. (2019)

סרטון זה מדגים הליך שלב אחר שלב לטיהור חלבון מתויג פוליהיסטידין המופרש מסטרפטוקוקוס מוטנס.

פרוטוקול

1. רכז חלבונים מהתרבית על ידי משקעים אמוניום גופרתי.
   הערה: חלץ מגופי תאים אם חלבון מטרה הוא תוך-תאי.
   1. צנטריפוגה תרבית חיידקים (Streptococcus mutans) מתלה למשך 20 דקות ב-10,000 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס.
   2. הוסף 1,122 גרם אמוניום גופרתי ל-2 ליטר של הסופרנטנט (80% רוויה) תוך ערבוב נמרץ באמצעות מערבל מגנטי. הניחו למשקעים להיווצר במשך 4 שעות או יותר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס תוך ערבוב.
      הערה: ניתן להמשיך את היווצרות המשקעים למשך הלילה.
   3. צנטריפוגה את התמיסה המשקעת אמוניום גופרתי ב-15,000 x גרם למשך 20 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
   4. אוספים את המשקעים בעזרת מרית ומעבירים לכוס זכוכית של 200 מ"ל. השעו מחדש את הכדורים ב-35 מ"ל של מאגר קשירה (50 מ"מ NaH₂PO₄, 300 מ"מ NaCl, 5 מ"מ אימידזול, pH 8.0).
   5. דיאליזה של התרחיף כנגד 2,500 מ"ל של מאגר הקישור באמצעות צינור דיאליזה תאית מחודש, בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, תוך ערבוב. החלף את תמיסת הדיאליזה לאחר שעתיים והמשך בדיאליזה למשך הלילה.
   6. החלף שוב את תמיסת הדיאליזה. המשך בדיאליזה במשך שעתיים נוספות.
2. צנטריפוגה את המתלה הדיאליזה ב-20,000 x גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. סנן את הסופרנטנט דרך מסנן ממברנה באמצעות ציוד סינון יניקה. מעבירים את המסנן לבקבוק^בגודל 75 ס"מ.
3. פרקו את ה-Glucosyltransferase-SI (GTF-SI) המתויג בפוליהיסטידין, מהתרחיף המסונן, על ידי כרומטוגרפיה של זיקה מתכתית (IMAC).
   1. העבר 2 מ"ל של תמיסת שרף IMAC טעונה Ni (כ-1 מ"ל שרף) לעמוד כרומטוגרפי שיציאתו מותאמת לצינור סיליקון. הסר את תמיסת האחסון על ידי זרימת הכבידה.
      זהירות: אל תאפשר לשרף להתייבש בכל ה-IMAC.
   2. הוסף 3 מ"ל מים מזוקקים לתוך העמוד כדי לשטוף את השרף. הוסף 5 מ"ל של מאגר הכריכה כדי לאזן את השרף.
   3. כבה את הזרם עם זין צביטה של הופמן. הוסף 5 מ"ל מהמתלה המסונן משלב 2 כדי ליצור את התרחיץ.
   4. הוסף את כל התרחיץ למתלה המסונן שנותר. מערבבים את התערובת בעדינות במשך 30 דקות בחום של 4 מעלות צלזיוס.
   5. טען את התערובת בחזרה על העמוד. הסר את המתלה על ידי זרימת כוח הכבידה. שטפו את שרף ה-IMAC עם 20 מ"ל של מאגר כריכה.
      הערה: התאם את קצב הזרימה לכ-2 מ"ל/דקה עם זין צביטה של הופמן לאורך ה-IMAC שלאחר מכן.
   6. הסר את ה-GTF-SI הרקומביננטי עם 20 מ"ל של מאגר הפליטה (50 מ"מ NaH₂PO₄, 300 מ"מ NaCl, 500 מ"מ אימידזול, pH 8.0).
      הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן. יש לאחסן את האלואט בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
יחידת אולטרה-סינון צנטריפוגלית	סרטוריוס	VS2032	תחליף חוצץ וריכוז חלבון
צנטריפוגה	קובוטה	תקן 7780ב
עמודה כרומטוגרפית	ביו-ראד	7321010	עבור IMAC
מהדק קרום דיאליזה	מותג פישר	21-153-100
צינורות דיאליזה	כאחד	2-316-06
אימידזול	וואקו	095-00015	מאגר מחייב והכנת מאגר פליטה
אינקובטור	ניפון מכשירים רפואיים וכימיים	LH-100-RDS	הגדרת טמפרטורה: 37 מעלות צלזיוס
מיקרוצנטריפוגה	קובוטה	3740
סודים כלוריד	וואקו	191-01665	הכנת מאגר מחייב ומאגר פליטה
נתרן דימימן פוספט דיהידראט	וואקו	192-02815	הכנת מאגר מחייב ומאגר פליטה
נתרן הידרוקסיד	וואקו	198-13765	הכנת מאגר מחייב ומאגר פליטה
אמוניום גופרתי	וואקו	015-06737	משקעי אמוניום גופרתי
שרף טעון Ni	ביו-ראד	1560133	עבור IMAC
פילטר ממברנה	מרק מיליפור	JGWP04700	קוטר 0.2 מיקרומטר