מדידת קשירת תרופות לקזאום מנגעי שחפת בשיטת דיאליזה בשיווי משקל מהיר

תקציר

מקור: Sarathy, J. P. et al. מבחן קשירת קזאום במבחנה המנבא חדירת תרופות בנגעי שחפת. J. Vis. Exp. (2017)

סרטון זה מדגים בדיקה חוץ גופית למדידת קשירת תרופות לקזאום מנגעי שחפת באמצעות דיאליזה מהירה בשיווי משקל. הוא מתאר את השלבים להכנת תרחיפי קזאום, ביצוע דיאליזה וחישוב חלק התרופה הלא קשור כדי לחזות את חדירת התרופה לקזאום.

פרוטוקול

1. בדיקת דיאליזה בשיווי משקל מהיר (RED).

1. ספייק 6.5 מיקרוליטר מתמיסת 500 מיקרומטר של תרכובת הבדיקה ל-643.5 מיקרוליטר של ההומוגנאט כדי להשיג את הריכוז הסופי של 5 מיקרומטר (≤1% DMSO) ומערבולת.
2. הנח את התוספות האדומות לתוך לוחית הבסיס. הוסף 200 מיקרוליטר של מטריצת התרופה לתוך תא התורם (טבעת אדומה) של כל תוספת RED ו-350 מיקרוליטר של מי מלח עם חוצץ פוספט (PBS) לכל תא מקלט. הכן 3 תוספות לכל תרכובת בדיקה (דוגמאות משולשות). אטמו את הצלחת עם אטם לוחית דבק ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס על התרמו-מערבל ב-200 סל"ד (1 x גרם) למשך 4 שעות.
3. לאחר הדגירה, ערבבו בעדינות את תכולת תאי התורם והמקבל על ידי פיפטינג למעלה ולמטה 2-3 פעמים. מוציאים 20 מיקרוליטר של הומוגנאט מתאי התורמים ומוסיפים ל-20 מיקרוליטר של PBS נקי בשפופרת של 1.5 מ"ל (1:1). באופן דומה, פיפטה מוציאים 20 מיקרוליטר של דגימות PBS מתאי המקלט ומוסיפים ל-20 מיקרוליטר של הומוגנאט נקי (התאמת מטריצה).
   הערה: התאמת מטריצה מבטלת את הצורך ב-2 עקומות כיול נפרדות (בהומוגנאט וב-PBS) לניתוח כמותני. תכולת תא התורם עלולה לשקוע עם הזמן. מערבבים בעדינות את התכולה על ידי פיפטינג לפני הסרת האליקוטים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
לוחית בסיס לשימוש חוזר של מכשיר Pierce RED	פישר סיינטיפיק	PI-89811
מוסיף מכשיר Pierce RED, 50/קופסה	פישר סיינטיפיק	פי-89809
כלי להסרת הכנסת Pierce RED	פישר סיינטיפיק	89812
חותם צלחת דבק	פישר סיינטיפיק	08-408-240
PBS, pH 7.4, 10x 500 מ"ל (Gibco)	טכנולוגיות חיים	10010-049
DMSO	סיגמא	472301